COMPOSICIÓN QUE COMPRENDE LA POLIPROTEÍNA NS3/NS4 Y EL POLIPÉPTIDO NS5B DEL VHC, VECTORES DE EXPRESIÓN QUE INCLUYEN LAS SECUENCIAS NUCLEICAS CORRESPONDIENTES Y UTILIZACIÓN EN TERAPÉUTICA.

Composición peptídica, caracterizada porque consiste en una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C,

así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C

La presente invención se refiere al campo de la vacunación profiláctica y terapéutica dirigida contra el virus de la hepatitis C (VHC). Tiene asimismo por objeto una nueva composición que contiene una poliproteína que corresponde a las dos proteínas colineales NS3 y NS4 (denominadas a continuación poliproteína NS3/NS4) y un polipéptido constituido por NS5b, los vectores, tales como adenovirus o poxvirus, capaces de expresar esta composición y su utilización como vacuna.

La hepatitis C es la causa principal de las hepatitis adquiridas por transfusión. La hepatitis C se puede transmitir asimismo por otras vías percutáneas, por ejemplo por inyección de drogas por vía intravenosa. Por otra parte, el riesgo de contaminación de los profesionales de la salud no es despreciable. La transmisión sexual ya ha sido descrita.

La hepatitis C se distingue de las demás formas de enfermedades del hígado asociadas a virus, tales como la hepatitis A, B o D. Las infecciones por el virus de la hepatitis C (VHC o HCV) son mayoritariamente crónicas, dando como resultado enfermedades del hígado, tales como hepatitis, cirrosis y carcinoma en un gran número de casos (5 a 20%) y representan en los países desarrollados 30% de los transplantes hepáticos.

Aunque el riesgo de transmisión del virus por transfusión haya disminuido por el hecho del establecimiento de ensayos de cribado en los años 1990, la frecuencia de nuevas infecciones por la hepatitis C sigue siendo elevada. A título de ejemplo, un estudio reciente indica que habría todavía en la actualidad 10.000 a 15.000 nuevos casos de infección por año en Francia (S. Deuffic et al., Hepatology 1999; 29: 1596-1601). Actualmente, aproximadamente 170 millones de personas en el mundo están infectadas de manera crónica por el VHC (hepatitis C: Global prevalence (update)", 2000, Weekly Epidermiological Record, Vol. 75(3)). Las poblaciones con riesgo elevado son principalmente el personal hospitalario y los usuarios de drogas intravenosas, pero existen donantes de sangre asintomáticos que no pertenecen a estos grupos de riesgo elevado, y en los que se han encontrado anticuerpos anti-VHC circulantes. Para estos últimos, no se ha identificado todavía la vía de infección. Existen por lo tanto unas infecciones por VHC (estimación de entre 5 y 10%), denominadas infecciones esporádicas, cuya etiología no se conoce y que no pueden ser controladas.

El VHC ha sido el primer virus hepatótropo aislado por medio de técnicas de biología molecular. Las secuencias del genoma vírico han sido clonadas antes de que la partícula vírica haya sido visualizada.

El VHC pertenece a un nuevo género de la familia de las Flaviviridae, los hepacivirus. Es un virus con ARN monocatenario positivo, de 9,5 kb, que se replica mediante una copia de ARN complementario, y cuyo producto de traducción es un precursor poliproteico de aproximadamente 3.000 aminoácidos. El extremo 5' del genoma del VHC corresponde a una región no traducida adyacente a los genes que codifican para las proteínas estructurales, la proteína core de la nucleocápside, las dos glicoproteínas de cubierta, E1 y E2, y una pequeña proteína denominada p7. La región no traducida 5' y el gen core están relativamente bien conservados en los distintos genotipos. Las proteínas de cubierta E1 y E2 están codificadas por regiones más variables de un aislado a otro. La proteína p7 es una proteína extremadamente hidrófoba que constituiría un canal iónico. El extremo 3' del genoma del VHC contiene los genes que codifican para las proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4, NS5) y para una región 3' no codificante que posee un dominio bien conservado (Major ME, Feinstone SM, Hepatology, junio de 1997, 25(6):1527-1538).

En la actualidad, la terapia más eficaz para el tratamiento de la hepatitis C, asocia el interferón pegilado y la ribavirina (Manns MP et al., The Lancet, 22 de septiembre de 2001, Vol. 358, 958-965). Mientras que esta terapia es particularmente eficaz en el caso de pacientes infectados por cepas víricas que pertenecen a los genotipos 2 y 3, ésta tiene solamente un efecto limitado sobre los genotipos 1a, 1b y 4 (Manns MP, supra). Menos del 50% de los pacientes tratados se vuelven unos "respondedores a largo plazo". Por otra parte, esta terapia es una intervención costosa (10.000 a 15.000 euro/paciente/año) y está asociada a unos efectos tóxicos. En efecto, 5 a 10% de los pacientes están obligados a interrumpir el tratamiento antes del final.

Por lo tanto, es necesario desarrollar una composición vacunal que tiene como diana todos los genotipos.

Varios estudios muestran, en la actualidad, que el control de una infección debida al VHC, o bien naturalmente (”resolución espontánea”), o bien después del tratamiento (“resolución terapéutica”), está asociada a la inducción o la potencialización de respuestas inmunitarias con mediación celular, haciendo intervenir los linfocitos T-CD4+ y TCD8+ (tal como se describe, por ejemplo, en LECHNER, F. et al., Eur. J. Immunol., 30:2479-2487 (2000) y en Thimme R. et al., 2001, J. Exp. Med., 194(10): 1395-1406).

Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH o también denominado HLA en el ser humano) son denominadas de clase I o de clase II. Las moléculas de clase I están expresadas sobre la casi totalidad de las células nucleadas y son capaces de presentar unos epítopos o péptidos a los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. Las moléculas de clase II son capaces de presentar unos epítopos a las células T CD4+, pero su expresión está restringida a las células presentadoras de antígeno.

Las vacunas contra el virus de la hepatitis C previstas actualmente se basan en la utilización de proteínas recombinantes adyuvantadas, de péptidos, de vectores de expresión entre los cuales se pueden citar los vectores de origen vírico o bacteriano o de ADN desnudo. En este caso, se utiliza una o varias proteínas víricas o uno o varios genes que codifican para estas proteínas víricas.

Cuando se seleccionan varias proteínas víricas o varios genes que codifican para estas proteínas víricas, están frecuentemente constituidas o bien por una parte o por el conjutno de las proteínas estructurales (Makimura et al., 1996, Vaccine, 14: 28-34; Fournillier A., et al, 1999, J. Virology, 73: 7497-7504), o bien por las proteínas no estructurales individuales o que comprenden por lo menos dos proteínas contiguas (Brinster et al., 2001, Hepatology, 34: 1206-1217), o bien por una mezcla de proteínas estructurales y no estructurales (Pancholi et al., 2003, J. Virology, 77:382-390).

La solicitud de patente WO 99/38880 describe la utilización de tres genes que codifican separadamente para las tres proteínas NS3, NS4 y NS5 (a y b) en una composición vacunal que comprende tres vacunas ADN que expresan cada una separadamente estas tres proteínas. Los autores muestran en el ratón la inducción de linfocitos T específicos de los tres antígenos. Sólo la vacuna que expresa NS5a y b ha sido ensayada in vivo en un ensayo de protección.

La solicitud de patente WO 01/30812 describe por su parte la utilización de una proteína de fusión constituida por las proteínas no estructurales NS3, NS4 y NS5a, llegado el caso en asociación con la proteína no estructural NS5b. Los autores han indicado que esta asociación permitía activar las células T específicas de VHC. Esta solicitud de patente describe simplemente la capacidad de formulaciones vacunales (tipo ADN desnudo, adenovirus recombinante o virus de la vacuna recombinante) que expresan la proteína de fusión NS3, NS4 y NS5a o la proteína NS5a para inducir unas respuestas inmunitarias específicas y mediadas por unos linfocitos T específicos.

Cho et al (Vaccine. 1999 Mar. 5; 17(9-10):1136-44) describen un método de vacunación que utiliza un vector de expresión que contiene la mitad 3' del genoma del VHC (nucleótidos 3395 a 9391, tal como se indica en el capítulo "2.1 plasmid construction", página 1137), y que codifica para una poliproteína constituida por los 4 polipéptidos NS3, NS4, NS5a y NS5b, estando el polipéptido NS5a presente necesariamente.

El solicitante ha demostrado ahora, contra toda previsión, que la asociación particular de las proteínas no estructurales NS3, NS4 y NS5b, siendo NS3 y NS4 expresadas de manera colineal, presentaba un mejor poder inmunógeno y protector superior al obtenido con una vacuna que incluye, además de estas proteínas no estructurales, asimismo la proteína NS5a y/u otras proteínas estructurales... [Seguir leyendo]

1. Composición peptídica, caracterizada porque consiste en una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C, así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C.

2. Composición peptídica según la reivindicación 1, caracterizada porque NS3 y/o NS4 y/o NS5b proceden de virus de genotipos diferentes.

3. Composición peptídica según la reivindicación 1, caracterizada porque NS3, NS4 y NS5b proceden de un virus de igual genotipo, preferentemente de genotipo 1b.

4. Vector de expresión para la expresión de secuencias nucleotídicas del virus de la hepatitis C, caracterizado porque dichas secuencias nucleotídicas del virus de la hepatitis C están constituidas por una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 y una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b, así como los medios necesarios para su expresión, estando dicha secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 y dicha secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b en un único vector de expresión.

5. Vector de expresión según la reivindicación 4, caracterizado porque las secuencias nucleotídicas que codifican para dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b proceden de virus de genotipos diferentes.

6. Vector de expresión según la reivindicación 4, caracterizado porque las secuencias nucleotídicas que codifican para dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b proceden de un virus de igual genotipo, preferentemente el genotipo 1b.

7. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque este vector es un plásmido, un vector vírico de tipo adenovirus, poxvirus, baculovirus, o un vector bacteriano de tipo salmonela, o BCG.

8. Vector de expresión según la reivindicación 7, caracterizado porque este vector es un adenovirus.

9. Vector de expresión según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho vector es un adenovirus humano, preferentemente el adenovirus 5.

10. Vector de expresión según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el genoma del adenovirus está modificado de manera que se sustituye la región E1 por el casete de expresión CMV-NS3-NS4 y se sustituye la región E3 por el casete de expresión SV40-NS5b.

11. Vector de expresión según la reivindicación 7, caracterizado porque este vector es un poxvirus.

12. Vector de expresión según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho poxvirus es un virus de la vacuna de la cepa Copenhagen o un virus de la vacuna modificado de Ankara.

13. Vector de expresión según la reivindicación 12, caracterizado porque presenta por lo menos una de las características siguientes, consideradas solas o en asociación:

i) el poxvirus es un virus MVA

ii) el poxvirus está en forma morfológica IMV

iii) el genoma del poxvirus está modificado de manera que se inserta el casete de expresión NS3/NS4 y se inserta el casete de expresión NS5b.

14. Vector de expresión según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque el genoma del poxvirus está modificado de manera que se inserta el casete de expresión ph5r-NS3-NS4 y se inserta el casete de expresión p7.5-NS5b.

15. Microorganismo o célula hospedante transformados por un vector de expresión tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14.

16. Utilización

- de una composición peptídica tal como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o bien

- de un vector de expresión tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, o bien

- de un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 del VHC con un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b del VHC, o bien

- de las secuencias nucleotídicas que codifican para dicha poliproteína NS3/NS4 y dicho polipéptido NS5b,

correspondiendo dichas secuencias nucleotídicas a las secuencias contenidas en los vectores de expresión tales como los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, dispuestas bajo el control de elementos necesarios para una expresión constitutiva y/o inducible de dichos péptidos,

para la preparación de un medicamento destinado a la inhibición, la prevención o el control de una infección provocada por el virus de la hepatitis C en un animal.

17. Utilización según la reivindicación 16, caracterizada porque el medicamento está destinado a la inhibición, la prevención o el control de una infección provocada por el virus de la hepatitis C en el ser humano.

18. Composición farmacéutica, que comprende a título de sustancia activa la composición peptídica tal como la definida en las reivindicaciones 1 a 3, o bien un vector de expresión tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, o bien un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 del VHC con un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b del VHC, así como los medios necesarios para su expresión.

19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizada porque comprende asimismo un vehículo farmacéuticamente apropiado.

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 18 ó 19, caracterizada porque es apropiada para una administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, tópica o transdérmica.

21. Kit farmacéutico, caracterizado porque comprende por lo menos un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 del VHC y por lo menos un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b del VHC, así como los medios necesarios para su expresión.

22. Kit farmacéutico, caracterizado porque comprende un vector de expresión tal como el definido en una de las reivindicaciones 7 a 10, y un vector de expresión tal como el definido en una de las reivindicaciones 11 a 14.

23. Kit farmacéutico, que comprende un vector de expresión tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, o bien un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 del VHC con un vector de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido NS5b del VHC, así como los medios necesarios para su expresión, y

a. por lo menos una composición peptídica tal como la definida en las reivindicaciones 1 a 3, o

b. por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3/NS4 del VHC y para el polipéptido NS5b del VHC.

24. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 o kit farmacéutico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizados porque se trata de una vacuna.