COMPUESTO DE SILICA-VINILSULFONA, SINTESIS Y USOS DEL MISMO.

Compuesto de sílica-vinilsulfona, síntesis y usos del mismo.

Compuesto que comprende un soporte de silica funcionalizada con grupos vinilsulfona.

Además, se refiere a su procedimiento de obtención y sus usos como inmovilizador de biomoléculas, y más concretamente de enzimas tales como invertasa, lactasa, peroxidasa o tiorredoxina h1, y de otras biomoléculas tales como glutatión, nitrosoglutation o biotina

Compuesto de sílica-vinilsulfona, síntesis y usos del mismo.

La presente invención se refiere a un compuesto de sílica conteniendo grupos vinilsulfona de fórmula general (I), a su procedimiento de obtención y a sus usos. Más particularmente, el uso de los compuestos de sílica en aplicaciones biotecnológicas.

Estado de la técnica anterior

La inmovilización de macromoléculas a soportes sólidos se remonta a comienzos del siglo XX con los trabajos de Nelson y Griffin (cfr. Nelson, J.M. et al., 1916 J. Am. Chem. Soc., vol. 38, pp. 1109-1115) sobre inmovilización de invertasa. El interés inicial por los enzimas inmovilizados y su actividad catalítica se ha ido extendiendo a otras macromoléculas. En la actualidad, la inmovilización de macromoléculas sobre un soporte sólido y el concepto de afinidad entre moléculas juegan un papel central en lo que se ha dado en denominar la era de las "omics" (cfr. Sheldon, R. A., 2007, Adv. Synth. Catal., vol. 349, pp.1289-1307). En este contexto se han descrito numerosas aproximaciones para inmovilizar macromoléculas a soportes con el objetivo de fabricación de microarrays (cfr. Sun, H. et al., 2006, Anal. Bioanal. Chem, vol. 386, pp. 416-426; Sun, X-L, Stabler, C.L., Cazalis, C.S., Chaikif, E.L., 2006, Bioconjugate Chem. vol. 17, pp. 52-57).

A pesar de los avances, aún persiste la necesidad de efectuar una "activación" para promover dicha inmovilización. Básicamente, existen dos métodos para llevar a cabo la mencionada activación: (a) activación de la macromolécula a inmovilizar; o (b) activación del soporte.

La primera de las metodologías (activación de la macromolécula a inmovilizar) ha tenido una amplia difusión y uso. En este sentido, mediante técnicas de Biología Molecular las proteínas pueden ser "activadas" vía fusión a colas o péptidos/dominios proteicos que le confieren afinidad por el soporte. Esta estrategia ha dado lugar al desarrollo de distintos sistemas comerciales entre los que se encuentran: (a) Colas de histidina ("His-Tag") (cfr. Hengen, P., 1995, Trends Biochem Sci. vol. 20, pp. 285-286.) en combinación con soportes conteniendo Ni (Quiagen, IBA, Amershem-Bioscience, Clontech); (b) Fragmento de la haloalcano deshalogenasa ("Halo-Tag") en combinación con soportes con haloalcano (Promega); (c) SNAP: O6-alquilguanina- ADN alquiltransferasa (cfr. Keppler, A. et al. 2004 Methods vol. 32, pp. 337-344) en combinación con soportes conteniendo O6-bencilguanina (Covalys); (d) Colas conteniendo péptidos con afinidad por estreptavidina ("Strep-tag") (cfr. Schmidt, TGM, et al., 1996 J. Mol. Biol. vol. 255, pp. 753-766) en combinación con soportes conteniendo estreptavidina (Novagen, IBA, Quiagen, Stratagene); (e) Glutatión transferasa en combinación con soportes conteniendo glutatión (Novagen, Clontech o Amershan-Biosciences); (f) Proteína de unión a maltosa en combinación con soportes con maltosa, (New England Biolab); (g) Péptido de unión a calmodulina en combinación con soportes conteniendo calmodulina (Stratagene); (h) Dominio de unión a celulosa en combinación con soportes conteniendo celulosa (Novagen); (i) Péptido biotinilado in vivo (cfr. Cronan, J.E., 1990, J. Biol. Chem vol. 265, pp. 10327-10333) en combinación con soportes conteniendo avidina (Promega); (j) IMPACT Inteina en combinación con soportes conteniendo quitina (New Englad Biolabs). Esta aproximación está limitada a proteínas recombinantes y generalmente conduce a una inmovilización no covalente de la macromolécula, hecho que determina su aplicación en purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad.

Otra opción para la activación de la macromolécula a inmovilizar es la introducción en su estructura de grupos químicos que le confieran reactividad o sobre los que se pueda llevar a cabo posteriores transformaciones químicas. Para proteínas, el grupo de elección es el grupo tiol (-SH) y la aproximación experimental usada es la mutagénesis dirigida o la fusión a una inteina (cfr. Girish, A., et al., 2005 Bioorg. Med. Chem. Lett., vol. 15, pp. 2447- 2451).

La segunda de las metodologías ("activación" de los soportes) supone la preparación de soportes sólidos conteniendo grupos funcionales reactivos para que reaccionen y formen un enlace covalente con las macromoléculas a inmovilizar. Los soportes que tradicionalmente se vienen empleando son la agarosa y el poliestireno. Los procedimientos clásicos de activación del soporte son: (a) el método de aminación reductiva (Pierce: agarosa y poliestireno funcionalizados con grupos tosil, tresil, epoxi, alquilamina, aldehído, hidrazida); (b) el método de cabonildiimidazol (Quiagen: poliestireno activado para reaccionar con SH, carboxi para ser activado con grupos succinimida o carbodiimida); (c) el método de la N-hidroxisuccinimida éster (Hispanagar: agarosa funcionalizada con grupos glioxal o aminoetil); (d) el método de la maleimida (Polygenetics: poliestireno funcionalizado con grupos amina ó CN); (e) el método de la hidrazida (Bangs Laboratories: poliestireno funcionalizado con grupos carboxi para ser activado con carbodiimida o grupos amino). Los grupos diana de la macromolécula son las aminas para los métodos (a), (b) y (c), los grupos tiol para el método (d) y los grupos aldehído, obtenidos por oxidación de carbohidratos, para el método (e).

El uso de la sílica/vidrio como soporte para la inmovilización de macromoléculas ha cobrado recientemente interés. En la actualidad existen en el mercado (a) sílica con Concanavalina A (Biotech Support Group) que interacciona con carbohidratos, (b) sílica con ácidos grasos (Nimbus Biotechnology) para incorporación de proteínas de membrana y (c) sílica con albúmina sérica humana (Nimbus Biotechnology). Las estrategias de inmovilización para este soporte sólido son las mismas que las indicadas para los otros soportes: (a) fusión de la proteína a inmovilizar con colas de Histidina (HisLink Resin de Promega en combinación con sílica con Ni de Biotech Support Group), con GST (sílica con glutatión de Biotech Support Group) con péptidos que interaccionan con estreptavidina (sílicas con estreptavidina de Bangs Laboratories y de Polysciences), con péptidos que interacciona directamente con la sílica (Arg-Tag14, Si-Tag15) b) empleo de soportes funcionalizados que permitan su fácil activación y reacción con la macro- molécula.

Por otro lado, las sulfonas a,ß-insaturadas (vinil sulfonas) son reconocidas como intermediarios sintéticos de gran utilidad debido fundamentalmente a su capacidad para participar en reacciones de adición 1,4 (aceptores de Michael) y en reacciones de cicloadición (como donores 2p). Adicionalmente, las vinilsulfonas son fáciles de preparar, a través de una amplia variedad de procesos sintéticos, y de manipular (Simphinks, N. S., 1990, Tetrahedron vol. 282, pp. 6951-6984; Meadows, D. C., et al., 2006, Med. Res. Rev. vol. 26(&) pp. 793-814). Estas características han encontrado recientemente utilidad en el diseño de fármacos y en química médica cuando se demostró su capacidad para inhibir de forma potente y reversible una variedad de procesos enzimáticos, fundamentalmente aquellos en los que están implicados cistein proteasas a las que se unen a través de reacciones de adición con el grupo tiol presente en el residuo de cisteína del sitio activo de estas enzimas. (cfr. Simphinks, N. S., 1990, Tetrahedron vol. 282, pp. 6951-6984; Meadows, D. C., et al., 2006 Med. Res. Rev. vol. 26(6), pp. 793-814).

La alta reactividad del grupo vinilsulfona ha sido explotada previamente en la preparación de distintos materiales conteniendo esta funcionalización: (i) poliestireno (comercializados por Aldrich) (ii) agarosa (comercializada por Gentaur) y (iii) sefarosa (comercializada por Affiland). Estos materiales han sido utilizados para el acoplamiento covalente con compuestos conteniendo grupos amina, tioles e hidroxilo habiendo encontrado aplicabilidad en la inmovilización de biomoléculas portadoras de estos grupos funcionales.

Además, el grupo vinilsulfona se usa en la preparación de intermedios de síntesis para la posterior obtención de materiales más elaborados, que contienen soportes de sílica. Estos materiales se suelen denominar resinas tiofílicas o "T-Gel" (cfr. Schwarz A. et al., 1994, Reactive Polymers vol. 22, pp. 256-266; GB 2 230 003 A; US 4,696,980; DE 10330204 A1). En este tipo de materiales el concepto...

1. Compuesto de fórmula general (I):

donde:

n tiene valores comprendidos entre 0 y 15.

X es S ó N.

R¹ es un grupo seleccionado de entre un alquilo (C₁-C₁₀), sustituido o no sustituido, o un grupo alquenilo(C₁-C₁₀), sustituido o no sustituido.

Y no existe o es el grupo -SO₂R², donde R² es un grupo alquilo (C₁-C₁₀) o un dialquilarilo ((C₁-C₁₀)Ar(C₁-C₁₀)).

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde n tiene un valor de 3.

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde X es S.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde X es N.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, donde R¹ es metilo.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde Y no existe.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 6, de fórmula (II)

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 6, de fórmula (III)

9. Método de obtención de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende:

a. obtención de sílica funcionalizada con grupos tiol o amina;

b. reacción del compuesto de sílica obtenida en el paso (a) con divinilsulfona en presencia de una base orgánica.

10. Método según la reivindicación 9, donde la base orgánica usada en el paso (b) es trietilamina.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, que además comprende el uso de THF-isopropanol como disolvente de la reacción del paso (b).

12. Compuesto de fórmula general (V):

donde n y R¹ están descritos en la reivindicación 1.

13. Compuesto según la reivindicación 12, donde n es 3.

14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde R¹ es metilo.

15. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como inmovilizador de biomoléculas.

16. Uso del compuesto según la reivindicación 15, donde las biomoléculas son enzimas, glutatión, nitrosoglutatión o biotina.

17. Uso del compuesto según la reivindicación 16, donde los enzimas se seleccionan de entre invertasa, lactasa, peroxidasa o tiorredoxina h1.