Un cristal que consiste en los restos aminoácido 17-111 de HDM2 del SEQ ID NO:

1, con un ligando, donde dicho ligando es un inhibidor de molécula pequeña de HDM2, donde dicho inhibidor de molécula pequeña no peptídico evita que HDM2 interaccione con p53, y donde dicho cristal tiene un grupo espacio seleccionado del grupo que consiste en un grupo espacio trigonal de P3221 y un grupo espacio tetragonal de P43212

Complejos inhibidores HDM2 y usos de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención tiene que ver generalmente con los campos de la biología molecular, la cristalización de proteínas, el análisis de difracción con rayos X, la determinación de la estructura tridimensional, el modelado molecular y el diseño racional de fármacos basado en la estructura. La presente invención proporciona péptidos HDM2 cristalizados así como descripciones de los patrones de péptidos así como las descripciones de los patrones de difracción de rayos X. Los patrones de difracción de rayos X de los cristales en cuestión tienen suficiente resolución de manera que se puede determinar la estructura tridimensional de HDM2 con resolución atómica, se pueden identificar los sitios de unión al ligando de HDM2, y se pueden modelar las interacciones de los ligandos con los restos aminoácido de HDM2.

Los mapas de alta resolución proporcionados por la presente invención y los modelos preparados utilizando tales mapas también permiten el diseño de ligandos que pueden funcionar como agentes activos. De este modo, la presente invención tiene aplicaciones en el diseño de agentes activos, que incluyen, pero no están limitados a, aquellos que encuentran uso como inhibidores de oncoproteínas MDM2 y HDM2.

Antecedentes de la invención

HDM2: Estructura y Función

La HDM2 (proteína de dobles diminutos humana 2) es el producto de la expresión en exceso de hdm2, un oncogén que es expresado en exceso en un subgrupo de tumores humanos incluyendo sarcomas de tejidos blandos, glioblastomas y carcinomas mamarios (Oliner, J.D. et al., Nature, 358(6381):80-83 (1992); Reifenberger, G. et al., Cancer Res., 53:2736-2739 (1993); Bueso-Ramos, C.E. et al., Breast Canc. Res. Treat., 37(2):179-188 (1996)).

La caracterización funcional de este oncogén reveló una interacción entre HDM2 y p53, un supresor tumoral central para detener el crecimiento celular y la apoptosis (Momand, G.P. et al., Cell, 69:1237 (1992)). HDM2 es una diana transcripcional de p53, y como tal, HDM2 y p53 forman un bucle regulado precisamente (Wu, X. et al., Genes and Dev., 7:1126-1132 (1992)). HDM2 es regulado adicionalmente por la ubiquitinación y por la formación de un complejo con Arf, que secuestra HDM2 en el nucleolo (Tao, W. and Levine, A.J., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 96 (12): 6937-6941 (1999); Weber, J.D. et al., Nat. Cell Biol., 1(1):20-26 (1999)).

Existen numerosas lineas de evidencia que sugieren que HDM2 también puede funcionar independientemente de p53. Se han encontrado variantes de empalme de HDM2 que no contienen el dominio de unión a p53 en tumores humanos y se ha demostrado que poseen capacidad transformante (Sigalas, I. et al. Nat. Med. 2(8):912-917 (1996)). Los estudios in vivo también han demostrado que el espectro de tumores que se desarrollan en ratones transgénicos que expresan HDM2 en exceso es diferente del espectro encontrado en ratones nulos para p53 y que HDM2 puede inducir sarcomagénesis en animales nulos para p53 (Jones, S.N. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 95 (26) :15608-15612 (1998)). Por último, otros compañeros de unión de HDM2 podrían ayudar a la función de HDM2 a lo largo de la ruta oncogénica, por ejemplo, inhibición por HDM2 de la detención de G1 independiente de p53 inducida por MTBP (Boyd, M.T. et al., J. Biol. Chem. 275 (41):31883-318 90 (2000)).

Los informes sobre el aumento de la muerte de células tumorales tras la inhibición de hdm2 por nucleótidos antisentido (Chen, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (1): 195-200 (1998); Chen, L. et al., Mol. Med., 5(1):21-34 (1999); Tortora, G. et al., Int. J. Cancer, 88 (5): 804-809 (2000)) y las mini-proteínas de unión a HDM2 (Bottger, A. et al., Curr. Biol., 7(11):860-869 (1997)) corroboran la predicción de que la inhibición de HDM2 activará p53 y a su vez desencadenará la apoptosis. Siguiendo con esta idea, cabría esperar que un inhibidor de molécula pequeña generado contra el surco de unión a p53 de HDM2 evitara la interacción de las dos proteínas e indujera la actividad de p53. Se ha sugerido adicionalmente que la inhibición de la interacción entre p53 y HDM2 actuará de forma aditiva o sinérgica con los agentes quimioterapéuticos convencionales en el tratamiento de neoplasmas, y esto también es apoyado por el trabajo en el que se utilizan constructos hdm2 antisentido (Wang, H. et al., Clin. Canc. Res. 7(11):3613-3624 (2001)).

MDM2: Estructura y Función

El mdm2, el homólogo murino de HDM2 se encontró originalmente en cromosomas diminutos dobles de ratón y se identificó inicialmente como uno de los tres genes amplificados en una línea celular tumorigénica (Cahilly-Snyder., L. et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:235-244' (1987)). Se encontró con posterioridad que su producto proteico forma un complejo con p53, que se observó primero en una línea celular de fibroblastos de rata (Clon 6) previamente transfectada con un gen p53 de ratón sensible a la temperatura (Michalovitz, D. et al., Cell 62:671-680 (1990)). La linea de células de rata creció bien a 37ºC pero mostró una detención en G1 cuando se desplazaba a 32ºC, lo que concordaba completamente con un desplazamiento dependiente de la temperatura observado en la conformación y la actividad de p53. No obstante, el complejo p53-MDM2 solamente se observaba en abundancia a 32ºC, temperatura a la cual p53 se encontraba predominantemente en forma funcional o de "tipo salvaje" (Barak, Y. et al., EMBO J. 11:2115-2121 (1992) y Momand, J. et al., Cell 69:1237-1245 (1992)). Desplazando la línea celular de rata a 32ºC y bloqueando la síntesis de proteína de novo se demostró que solamente la p53 de "tipo salvaje" inducía la expresión del gen mdm2, explicando de ese modo la abundancia diferencial del complejo en términos de la actividad transcripcional de p53 (Barak, Y. et al., EMBO J. 12:461-468 (1993)). La explicación se desarrolló adicionalmente mediante la identificación de un sitio de unión al ADN para p53 de tipo salvaje en el primer intrón del gen mdm2 (Wu, X. et al., Genes Dev. 7:1126-1132 (1993)). Los constructos informadores que empleaban este sitio de unión al ADN de p53 revelaron que eran inactivados cuando p53 de tipo salvaje era expresada simultáneamente con MDM2.

Esta inhibición de la actividad transcripcional de p53 puede estar causada por el bloqueo por MDM2 del dominio de activación de p53 y/o el sitio de unión al ADN. Por consiguiente, se propuso que la expresión de mdm2 está autorregulada, por medio del efecto inhibidor de la proteína MDM2 sobre la actividad transcripcional de p53 de tipo salvaje. Este bucle de retroalimentación autorreguladora de p53-mdm2 proporcionó una nueva percepción en cuanto a cómo podría estar regulado el crecimiento celular por p53. Se considera que hasta un tercio de los sarcomas humanos superan el control del crecimiento regulado por p53 mediante la amplificación del gen mdm2 (Oliner, J.D. et al., Nature 358:80-83 (1992)). Por lo tanto, la interacción entre p53 y MDM2 representa una diana terapéutica potencial clave.

p53: Interacción con HDM2 y MDM2

p53 es un factor de transcripción para numerosas proteínas que ocasionan la detención del ciclo celular o la muerte celular mediante apoptosis, tales como p21, 14-3-3s, y bax. El nivel y la actividad transcripcionales de p53 se incrementan por los daños en el ADN celular. La proteína MDM2 inhibe la función de p53 uniéndose a una hélice N-terminal anfipática de p53, abrogando la interacción de p53 con otras proteínas y su actividad de transactivación. La interacción con MDM2 también dirige p53 a la degradación de proteína dependiente de ubiquitina. MDM2 también muestra efectos independientes de p53 sobre el ciclo celular, posiblemente mediante la interacción directa con algunos de los efectores aguas abajo tales como pRB y EF2 (Revisado por Zhang, R. and Wang, H., Cur. Pharm. Des. 6:393-416 (2000)).

Las mutaciones de la proteína p53 se producen en el 50% de todos los cánceres humanos (revisado por Agarwal, M.L. et al. J. Biol. Chem. 273:1-4 (1998); Levine, A.J., Cell 88:323-331(1997); y, referencias citadas en Oren; M., J. Biol. Chem. 274:36031-36034 (1999)). En circunstancias normales, p53 es una proteína latente y muy lábil, que funciona con una vida media muy corta de unos pocos minutos (Rogel, A. et al., Mol. Cell. Biol. 5:2851-2855 (1985)). La lesión o el estrés del ADN inducen un notable incremento de la estabilidad de p53 (Kastan, M.B. et al.,...

1. Un cristal que consiste en los restos aminoácido 17-111 de HDM2 del SEQ ID NO: 1, con un ligando, donde dicho ligando es un inhibidor de molécula pequeña de HDM2, donde dicho inhibidor de molécula pequeña no peptídico evita que HDM2 interaccione con p53, y donde dicho cristal tiene un grupo espacio seleccionado del grupo que consiste en un grupo espacio trigonal de P3₂21 y un grupo espacio tetragonal de P4₃2₁2.

2. El cristal de la reivindicación 1, donde el cristal difracta eficazmente los rayos X para la determinación de las coordenadas atómicas para una resolución de al menos aproximadamente 3,0 Å.

3. El cristal de la reivindicación 1, donde dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en Ácido (4-cloro-fenil)-[3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-acético; Ácido [8-cloro-3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-(4-cloro-fenil)-acético); y sus derivados.

4. Un método para la producción de un complejo cristalino que comprende un polipéptido HDM2-ligando que comprende:

donde el polipéptido HDM2 consiste en los restos aminoácido 17-111 del SEQ ID NO:1.

5. El método de la reivindicación 4, donde dicho PEG tiene un intervalo de peso molecular medio de 100 a 1.000, donde dicho PEG está presente en solución en un intervalo de aproximadamente 0,5% p/v a aproximadamente 10% p/v y dicho NaSCN está presente en solución en un intervalo de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM.

6. El método de la reivindicación 5, donde dicho PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 400 y está presente en solución a aproximadamente 2% p/v y dicho NaSCN está presente en solución a aproximadamente 100 mM.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicha solución comprende adicionalmente (NH₄)₂SO₄ aproximadamente 1,8-2,4 M y tampón aproximadamente 100 mM.

8. Un método para la producción de un cristal de la reivindicación 1 que comprende:

9. Un método para la producción de un complejo cristalino que comprende:

mezclar 1-2 µl de proteína HDM2 que consiste en los aminoácidos 17-111 del SEQ ID NO: 1 formando complejo con una molécula pequeña y concentrada a aprox. 10 mg/ml a una razón 1:1 con solución de pocillo ((NH₄)₂SO₄ 1,8-2,4 M y tampón 100 mM pH 6,5-9,0, PEG 400 al 2%, NaSCN 100 mM);

colocar dicha solución mixta sobre un cubre de vidrio;

invertir el cubre de vidrio y sellar el cubre de vidrio sobre un reservorio de 500-1000 µl de solución de pocillo;

incubar el cubre de vidrio a 4ºC durante aproximadamente 3 a aproximadamente 7 días para permitir la formación de cristales; y

recoger los cristales.