BIOCONJUGADOS NO COVALENTES UTILES PARA DIAGNOSTICO Y TERAPIA.

Una composición que comprende bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula:

HM ---- CM en la que HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina

Bioconjugados no covalentes útiles para diagnóstico y terapia.

Antecedentes del invento

Este invento pertenece a bioconjugados de hapteno-portador no covalentes y a su uso para entregar selectivamente agentes de diagnóstico y terapéuticos a tejidos y órganos objetivo. Particularmente, este invento pertenece a la entrega selectiva de bioconjugados fluorescentes de hapteno-portador no covalentes a un lugar o región específico con el propósito de determinar la estructura y función de tejidos u órganos usando procedimientos de formación de imágenes tomográficos ópticos, procedimientos de vigilancia por fluorescencia, procedimientos de vigilancia por absorbancia, o procedimientos de examen endoscópico.

Las fuerzas intermoleculares no covalentes (por ejemplo electrostáticas, de unión por hidrógeno e interacciones de Van der Waals) desempeñan una función vital en muchos procesos biológicos tales como catálisis de enzimas, interacción droga-receptor, interacción antígeno-anticuerpo, interacción biotina-avidina, formación de ADN de doble hélice, fagocitosis, pigmentación en plantas y animales, y transporte celular. La variedad de colores observados en flores y plantas por ejemplo, es atribuida a la asociación no covalente entre los pigmentos naturales e hidratos de carbono o proteínas encontrados en las células de las plantas.

Las fuerzas no covalentes pueden alterar las propiedades fisicoquímicas y/o biológicas de haptenos o portadores. Por ejemplo, la asociación de un tinte o una molécula de pigmento con proteínas o hidratos de carbono puede cambiar la estabilidad química o la fotoestabilidad, cambiar la intensidad y/o la longitud de onda de máxima absorción/emisión, o ambas. Aunque la energía de interacción por unidad de interacción es muy pequeña (es decir menor de 40 kJ/interacción), el efecto acumulativo de múltiples puntos de interacción a lo largo de las dos superficies puede ser sustancial y puede conducir a una fuerte aglutinación entre el hapteno y el portador. Esta aproximación ha sido usada satisfactoriamente para preparar anticuerpos anti-ADN. El ADN es una macromolécula aniónica muy cargada que normalmente no es inmunogénica; sino que, cuando es hecha más compleja con una albúmina de suero bovino metilado catiónico muy cargada (MBSA), el ADN resulta inmunogénico. Así, el bioconjugado de ADN-MBSA no covalente era lo bastante estable para provocar una respuesta inmune hacia el ADN.

Interacciones no específicas también desempeñan un papel importante en los procesos biológicos. Por ejemplo, la albúmina de suero humano aglutina distintas moléculas de una manera no selectiva y facilita el transporte de estas moléculas a través del sistema vascular a las células.

Así, queda claro a partir de los ejemplos anteriores que los bioconjugados unidos de modo no covalente funcionan biológicamente como una única unidad. Además de las propiedades antes mencionadas, la molécula portadora puede también proteger algunos haptenos de degradación química, fotoquímica o radiolítica. El presente invento pretende explotar el concepto de interacciones no covalentes en el diseño de nuevos bioconjugados para diagnosis y terapia.

Además, el uso de tintes y bioconjugados de tinte covalentes para la detección de distintas especies en los fluidos corporales es bien conocido en el campo de inmunodiagnósticos in vitro. Inmunoconjugados de tinte han sido ampliamente usados en inmunohistología, y la detección inmunoquímica de distintos antígenos, hormonas, drogas y similares en fluidos corporales mediante procedimientos de radioinmunoensayos (RIA) o ensayos inmunoabsorbentes de enlace enzimático (ELISA). Tintes fluorescentes han sido también usados como quimiosensores y en microscopia fluorescente. (J.P. Desvergne y A.W. Czarnik, Quimiosensores de Reconocimiento de Ión y Molécula, Kluver Academic, Boston, 1997; B.H. Satir, Ed., Técnicas No invasivas en Biología Celular, Wiley-Liss, New York, 1990). El verde de Indocianina, un tinte de polieno muy fluorescente, ha sido usado para vigilar el gasto cardiaco, valorar la función hepática, y formar imágenes tomográficas de tumores (K. Licha y col., Síntesis y Caracterización de Tintes de Cianina como Agentes de Contraste para Formación de Imágenes Próximas a los Infrarrojos; SPIE, 1996, vol. 2927, 192-197; X. Li y col., Localización de Tumores Usando Fluorescencia de Verde de Indocianina en Ratas Modelo, SPIE 1995, Vol. 2389, 789-798; B. Riefke y col., Caracterización in vivo de Tintes de Cianina como Agentes de Contraste para Formación de Imágenes Próximas a los Infrarrojos, SPIE, 1996, vol. 2927, 199-208).

En química de bioconjugados tradicional, los conjugados son preparados por enlace o unión covalente de distintas moléculas efectoras tales como drogas, hormonas, agentes radiofarmacéuticos, agentes de formación de imágenes por resonancia magnética, agentes quimioterapéuticos, y similares a los portadores bioactivos. Tal proceso implica a menudo una manipulación química engorrosa de los dos componentes, además de la síntesis complicada de haptenos activados apropiados necesarios para la unión o enlace covalente. Además, la bioactividad del complejo resultante es, en muchos casos, o bien muy disminuida o bien obviada en su totalidad.

Los tintes de polieno, en general, y el verde de indocianina, en particular, tiene varias desventajas que limitan su uso como agentes de contraste próximos a los infrarrojos (NTR). El verde de indocianina tiene una mitad de vida de plasma muy corta y es rápidamente absorbida por el hígado (D.K. Meijer y col., Farmacocinética de Excrección Biliar en el Hombre. VI. Verde de Indocianina, Eur. J. Clin. Pharmacol., 1998, Vol. 35, 295-303); tiene baja eficiencia de fluorescencia y sufre degradación en medio acuoso con pérdida de fluorescencia. Por ello, hay una necesidad de nuevos bioconjugados que sean simples de preparar y lo suficientemente estables para ser útiles como un agente de diagnóstico o terapéutico.

El documento DE 4445065 se refiere a un método para etiquetar anticuerpos antitumorales con propósitos oftalmológicos, en particular anticuerpos específicos para melanoma y cáncer de colon, usando fluoresceína y verde de indocianina (ICG).

El documento DE 3828360 se refiere a un proceso para el etiquetado no covalente de anticuerpos antitumorales con un tinte, en particular con fluoresceína o indocianina, y a los anticuerpos específicos de etiquetado de tinte que son obtenidos de ese modo.

Sauda K. y col. (Química Analítica, 1986, 58(13), 2649-2653) describe que ICG forma un complejo no covalente con una variedad de proteínas no específicamente. Describe que la ICG unida a BSA es más estable que la ICG en solución acuosa.

Davis, D.R. y col. (Comunicaciones de Investigación en Patología Química y Farmacología, 1980, 27(2), 373-388) describe que la ICG aglutina de forma competitiva las proteínas de citosol del hígado de la rata ligandina y Z.

Paumgartner G. (Schweizerische Medizinische Wochenschrift, 1975, 105(17s), 1-30) describe que después de la inyección la ICG es rápida y completamente unida a proteínas de plasma, tales como albúmina o globulinas, o a proteínas intracelulares designadas Y y Z.

Objetos del invento

Es, por ello, un objeto del presente invento proporcionar bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que son simples de preparar y son útiles en procedimientos médicos de diagnóstico y terapéuticos.

Es otro objeto del presente invento proporcionar bioconjugados que son estables durante el almacenamiento antes de ser usados en procedimientos médicos de diagnóstico y terapéuticos.

Es aún otro objeto del presente invento proporcionar un método para realizar un diagnóstico o procedimiento terapéutico en un paciente.

Es otro objeto del presente invento proporcionar un método para alterar la persistencia en la sangre de un hapteno.

Es otro objeto del presente invento proporcionar un método para aumentar la vida fluorescente in vitro e in vivo de un tinte fluorescente.

Resumen del invento

El invento proporciona una composición que comprende bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula: HM------CM, donde HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido...

1. Una composición que comprende bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula:

HM ---- CM

en la que HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina.

2. La composición según la reivindicación 1, en la que CM es ácido poliaspártico.

3. La composición según la reivindicación 1, en la que CM es ácido poliguanílico.

4. Un bioconjugado de hapteno-portador no covalente que tiene la fórmula:

HM ---- CM

en la que HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina, para uso en diagnosis o terapia.

5. El bioconjugado de hapteno-portador no covalente según la reivindicación 4, para usar en un procedimiento seleccionado del grupo de procedimientos de formación de imágenes tomográfico óptico, procedimientos de vigilancia de fluorescencia, procedimientos de vigilancia de absorbancia, y procedimientos de examen endoscópico.

6. El bioconjugado de hapteno-portador no covalente según la reivindicación 4, para usar en un procedimiento de vigilancia de fluorescencia.

7. El bioconjugado de hapteno-portador no covalente según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que CM es ácido poliaspártico.

8. El bioconjugado de hapteno-portador no covalente según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que CM es ácido poliguanílico.

9. Un método de alterar la persistencia en sangre de un hapteno que comprende la formación de bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula:

HM ---- CM

en la que HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina.

10. Un método de aumentar la vida fluorescente in vitro e in vivo de una molécula de hapteno formando bioconjugados de hapteno-portador no covalentes que tienen la fórmula:

HM ---- CM

en la que HM es verde de indocianina; CM es una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de ácido poliaspártico y ácido poliguanílico; y la línea de trazos es un enlace no covalente entre la molécula portadora y el verde de indocianina.

11. El método según la reivindicación 9 o 10 en el que CM es ácido poliaspártico.

12. El método según la reivindicación 9 o 10 en el que CM es ácido poliguanílico.