Molécula de anticuerpo anti-humano ED-B que consta de un dominio de anticuerpo VH y un dominio de anticuerpo VL,

en el que el dominio de anticuerpo VH tiene la secuencia de aminoácidos:

Anticuerpos derivados de anti ED-B L19 y vasculatura tumoral objetivo.

La presente invención se refiere a la selección de la vasculatura del tumor utilizando moléculas de anticuerpo. En particular, la invención se refiere a la utilización de moléculas de anticuerpos que se unen a ED-B de la fibronectina, y que son de utilidad demostrada en la selección del tumor. En diferentes realizaciones de la presente invención, moléculas de anticuerpos se emplean en diferentes formatos moleculares. En algunas realizaciones las moléculas de anticuerpo comprenden IgG1 humana. En otras realizaciones las moléculas de anticuerpos son mini-inmunoglobulinas, como son generadas fusionando una molécula de anticuerpo scFv al dominio constante CH4 de una isoforma IgE secretora que naturalmente contiene una cisteína en su terminal COOH que forma un dímero covalentemente unido. La tasa de separación de la sangre, estabilidad in vivo y otras propiedades ventajosas son empleadas en diferentes aspectos y realizaciones de la invención, por ejemplo, en la selección del tumor. El diferente comportamiento in vivo de los diferentes formatos de molécula de anticuerpos puede ser explotado con diferentes fines de diagnóstico y/o terapéuticos, dependiendo de las necesidades clínicas y la enfermedad.

A pesar de su enorme potencial como agentes terapéuticos, los anticuerpos monoclonales (AcM) de origen no humano han tenido un mal desempeño en los ensayos clínicos como resultado de su inmunogenicidad (1 Shawlert et al., 1985, 2 Miller et al., 1983), pobres propiedades farmacocinéticas (3 Hakimi, et al., 1991, 4 Stephens et al., 1995) e ineficiencia en funciones efectoras de reposición (5 Riechmann et al., 1988; 6 Junghens et al., 1990). La reciente posibilidad de aislar fragmentos de anticuerpos humanos de las bibliotecas de fagos (7 McCafferty et al., 1990, 8 Lowman et al., 1991; para revisiones, véase 9 Nilsonn et al., 2000 y 10 Winter, et al., 1994) trasciende estos problemas, revitalizando estudios y reavivando las esperanzas de la utilización de estos reactivos para el tratamiento de enfermedades graves. En efecto, estas moléculas deben servir como bloques de construcción ideal para los nuevos instrumentos diagnósticos y terapéuticos (11 Reichert, 2001; 12 Huls et al., 1999). Además, estos anticuerpos pueden ser "madurados" para llegar a las afinidades en el rango picomolares (13 Pini et al., 1998), por lo menos deseable, si no necesario, para su uso clínico.

Las aplicaciones clínicas de los fragmentos de anticuerpos humanos para la entrega selectiva de los agentes terapéuticos o de diagnóstico, no obstante requieren objetivos muy específicos. En el caso de los tumores, los objetivos más populares son los antígenos de superficie celular, que no suelen ser ni abundantes ni estables. Sin embargo, durante la progresión tumoral, el microambiente que rodea las células del tumor sufre una modificación importante que genera un "ambiente tumoral", que representa un objetivo de la terapia del tumor basada en anticuerpos (14 Neri y Zardi, 1998). De hecho, el concepto de que el microambiente tumoral alterado es en sí mismo un carcinógeno que puede ser seleccionado adquiere cada vez mayor consenso. Moléculas que son capaces de suministrar de manera efectiva agentes terapéuticos en el microambiente tumoral representan, por tanto, nuevos instrumentos prometedores e importantes para la terapia del cáncer (15 Bissell, 2001; 14 Neri y Zardi, 1998).

La fibronectina es un componente matriz extracelular (ECM), que se encuentra distribuido ampliamente en una variedad de tejidos normales y los fluidos corporales. Diferentes isoformas FN pueden ser generados por el procesamiento alternativo del pre-ARNm FN, un proceso que es modulado por citocinas y el pH extracelular (16 Balza et al., 1988, 17 Carnemolla et al., 1989, 18 Borsi et al. 1990; 19 Borsi et al., 1995). La repetición completa ED-B de tipo III, también conocida como la repetición B de extratipo III B (EIIIB), puede ser totalmente incluido u omitido en la molécula FN (20 Zardi et al., 1987). ED-B es altamente conservado en diferentes especies, que tienen 100% de homología en todos los mamíferos estudiados hasta la fecha (humano, rata, ratón, perro) y el 96% de homología con un dominio similar en los pollos. La isoforma FN que contiene ED-B (B-FN) no es detectable de forma inmunohistoquímica en tejidos adultos normales, con excepción de los tejidos sometidos a remodelación fisiológica (por ejemplo, de endometrio y ovario) y durante la curación de heridas (17 Carnemolla et al., 1989, 21 ffrench-Constant, et al., 1989). Por el contrario, su expresión en tumores y tejidos fetales es alta (17 Carnemolla et al, 1989). Además, se ha demostrado que B-FN es un marcador de la angiogénesis (22 Castellani et al., 1994) y que las células endoteliales que invaden los tejidos tumorales migran a lo largo de las fibras de ECM que contienen de B-FN (23 Tarli et al. 1999).

La señalización selectivo de la vasculatura tumoral se ha descrito utilizando un anticuerpo recombinante humano, scFv(L19) (13 Pini et al., 98), específico para la isoforma B-FN (24 Carnemolla et al., 1996, 23 Tarli et al. 99, 25 Viti et al., 99, 26 Neri et al., 97, 27 Demartis et al., 2001). El anticuerpo puede ser utilizado tanto en diagnóstico in vivo (inmunogammagrafía) y en enfoques terapéuticos que impliquen la entrega selectiva de radionucleidos terapéuticos o de agentes tóxicos a la vasculatura tumoral. Además, Birchler et al. (28 1999) demostró que scFv(L19), químicamente acoplado a un fotosensibilizante, se acumula selectivamente en los vasos sanguíneos recién formados del modelo córnea de conejo angiogénica y, tras la irradiación con luz infrarroja cercana, media la oclusión completa y selectiva de la neovasculatura ocular.

Más recientemente, Nilsson et al. (29 2001) describió que el inmunoconjugado de scFv(L19) con el dominio extracelular del factor tisular media el infarto selectivo en diferentes tipos de modelos de tumores murinos. Además, las proteínas de fusión de scFv(L19) y de IL-2 e IL-12 han demostrado la eficacia terapéutica mayor de estas dos citoquinas (30 Halin et al., presentado; 31 Carnemolla et al., 2002). Ver también WO01/62298 para el uso de fusiones en el tratamiento de lesiones de angiogénesis patológica, incluyendo los tumores. Finalmente, dado que L19 reacciona igual de bien con ED-B de ratón y humano, puede ser utilizado tanto para los estudios pre-clínicos como clínicos.

Ver también los documentos WO 97/45544, WO 99/58570, WO 01/62800 y WO 01/62298.

Diferentes formatos de anticuerpos han mostrado un comportamiento diverso en términos de estabilidad in vivo, remoción y funcionamiento en la selección del tumor (32 Wu et al., 2000). Una mini-inmunoglobulina o inmunoproteína pequeña (SIP) se describe en (Li et al 33., 1997).

La presente invención se basa en la preparación, caracterización e investigación de la biodistribución in vivo de moléculas de anticuerpos humanos L19 en diferentes formatos, a saber, scFv, mini-inmunoglobulina e IgG1 completa.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra modelos que ilustran las estructuras de diferentes proteínas. A: Modelo de la estructura de dominio de una subunidad FN. Las secuencias de proteínas sometidas a empalmado alternativo se indican en gris. Como se indicó, el epítope del anticuerpo recombinante L19 se localiza dentro de la repetición ED-B. B - D: Esquemas de las construcciones utilizadas para expresar, respectivamente, L19 (scFv) (B), L19-SIP (C), y L19-IgG1/?.

La figura 2 muestra curvas de crecimiento del tumor SK-MEL-28 en ratones desnudos (triángulos) y del tumor F9 en cepas en ratones 129 (círculos). El volumen (mm³) se representa respecto al tiempo (días). Cada punto de datos es el promedio de seis ratones pm SD.

La Figura 3 muestra los resultados de la cromatografía de exclusión de tamaño de los diferentes formatos L19. En los paneles A, B y C se muestran perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño (Superdex 200) de los formatos de L19 scFv, mini-inmunoglobulina e IgG1, respectivamente, después de radioiodinación. Paneles D, E y F muestran los perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño (Superdex 200) de plasma en los tiempos indicados después de la inyección intravenosa de los formatos de L19 radioiodados, scFv, mini-inmunoglobulina e IgG1,...

1. Molécula de anticuerpo anti-humano ED-B que consta de un dominio de anticuerpo VH y un dominio de anticuerpo VL, en el que el dominio de anticuerpo VH tiene la secuencia de aminoácidos:

y en el que el anticuerpo de dominio VL tiene la secuencia de aminoácidos:

en donde la molécula de anticuerpo comprende una mini-inmunoglobulina que comprende dicho dominio anticuerpo VH y dominio VL anticuerpo fusionado a varepsilon_S2-CH4 y dimerizado.

2. Molécula de anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el dominio de anticuerpo VH y dominio de anticuerpo VL se encuentran dentro de una molécula de anticuerpo scFv fusionado a varepsilon_S2-CH4.

3. Molécula de anticuerpo según la reivindicación 2 en la que la molécula de anticuerpo scFv está fusionada con varepsilons₂-CH4 a través de un péptido enlazador.

4. Molécula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3 en el que el péptido enlazador tiene la secuencia de aminoácidos GGSG (SEQ ID NO. 7).

5. Molécula de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se conjuga con un radioisótopo.

6. Molécula de anticuerpo según la reivindicación 5, donde el radioisótopo es un radioisótopo de Tc, Re, In, Y o Lu.

7. Molécula de anticuerpo, según la reivindicación 5, donde el radioisótopo es seleccionado del grupo formado por ^94mTc, ^99mTc, ¹⁸⁶Re, ²⁰³Pb, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁴³Sc, ⁴⁷Sc, ^110mIn, ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁸Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ¹²¹Sn, ¹⁶¹Tb, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁰⁵Rh, ¹⁷⁷Lu, ¹⁷²Lu y ¹⁸F.

8. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos o secuencias de nucleótidos que codifican una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. Célula huésped transformada con ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Procedimiento de producción de una molécula de anticuerpo, comprendiendo el procedimiento el cultivo de las células del huésped, según la reivindicación 9 en condiciones para la producción de dicha molécula de anticuerpo.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, que comprende además el aislamiento y/o purificación de dicha molécula de anticuerpo.

12. Procedimiento según la reivindicación 10 o la reivindicación 11 que comprende además la formulación de la molécula de anticuerpo en una composición que incluye al menos un componente adicional.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 que comprende además unir la molécula de anticuerpo a ED-B o un fragmento de ED-B in vitro.

14. Procedimiento que comprende unir una molécula de anticuerpo que se une a ED-B, de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 al ED-B o un fragmento de ED-B in vitro.

15. Procedimiento según la reivindicación 13 o la reivindicación 14 que comprende la determinación de la cantidad de unión de la molécula de anticuerpo a ED-B o un fragmento de ED-B.

16. Composición que comprende una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante la terapia.

17. Composición según la reivindicación 16 para su uso en un procedimiento de tratamiento de una lesión de angiogénesis patológica.

18. Composición según la reivindicación 16 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un tumor.

19. Utilización de una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una lesión de angiogénesis patológica.

20. Utilización de una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.

21. Composición que comprende una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante la terapia.

22. Composición según la reivindicación 21 para uso en un procedimiento de tratamiento de una lesión de angiogénesis patológica.

23. Composición según la reivindicación 22 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un tumor.

24. Utilización de una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una lesión de angiogénesis patológica.

25. Utilización de una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.