La invención define un procedimiento para analizar plaguicidas en frutos secos que comprende las etapas de:

(a) extraer con disolventes los plaguicidas del fruto seco;

(b) someter el extracto obtenido en la etapa (a) a cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa; y

(c) someter el extracto eluido obtenido en la etapa (b) a cromatografía de gases;

en el que el acoplamiento entre la cromatografía líquida y la cromatografía de gases se efectúa mediante la interfase TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption). Este procedimiento permite analizar plaguicidas en frutos secos de un modo rápido, sencillo, reproducible, fiable y sin apenas manipulación de la muestra, con unos límites de detección muy inferiores a los niveles máximos de residuos (MRLs) establecidos por la legislación europea, y con una repetibilidad satisfactoria tanto del análisis como de todo el procedimiento (extracción y análisis)

Procedimiento para analizar plaguicidas en frutos secos.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de los métodos de análisis aplicados a alimentos. En particular, la invención se refiere a un procedimiento para analizar plaguicidas en frutos secos.

Antecedentes de la invención

Como es bien conocido en el estado de la técnica, los frutos secos contienen una gran cantidad de antioxidantes naturales. Así, por ejemplo, los pistachos se han clasificado recientemente entre los 50 productos alimenticios con mayor potencial antioxidante (Halvorsen B.L. et al., "Content of redox-active compounds (i.e. antioxidant) in food comsumed in the United States", Am. J. Clin. Nutr. 2006, 53, 5003-5009).

Los pistachos son una fuente rica en compuestos bioactivos antioxidantes, especialmente fitoestrógenos, cuyo consumo diario se asocia a una disminución de la incidencia de enfermedades cardiovasculares y determinados tumores (Gentile C. et al., "Antioxidant activiy of Silican Pistachio (Pistacia ver L. Var. Bronte) nut extract and its bioactive components", J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 643-648). Recientemente se han descrito los efectos positivos de los pistachos sobre el estado oxidativo de individuos sanos (Kocyigit A. et al, "Effects of pistachio nut comsumption on plasma lipid profile and oxidative status in healthy volunteers", Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 2006, 16, 202-209). Los pistachos se usan principalmente como aperitivo, crudos o tostados, como ingrediente de pastelería y en la fabricación de carnes fermentadas, helados, pan, salsas y pudings.

En el cultivo del pistacho es habitual el uso extendido de plaguicidas y, por tanto, es necesario un control estricto a fin de proteger al consumidor del impacto perjudicial de sus residuos. La mayoría de los plaguicidas son hidrófobos y son absorbidos en matrices lipídicas tales como los frutos secos (con un contenido de grasa del 50-70%), pasando de este modo al consumidor.

Habitualmente, el control de los residuos de plaguicidas se lleva a cabo mediante métodos analíticos que incluyen etapas de extracción con disolventes, limpieza y concentración, seguidas de cromatografía de gases con diversos detectores. El aislamiento de analitos del pistacho y de otros frutos secos es una tarea complicada y laboriosa debido a la naturaleza grasa de su matriz. La etapa crucial en el procedimiento analítico para su determinación es la separación de los residuos de plaguicidas de la masa de material lipídico, ya que incluso una pequeña cantidad de lípidos puede deteriorar los inyectores, las columnas capilares y los detectores del cromatógrafo de gases. Además, las interferencias de la matriz lipídica pueden ocasionar problemas en la señal analítica de los plaguicidas analizados. Por ello, tras la extracción es necesaria una etapa posterior de limpieza. Para tal fin, se han usado diversas técnicas, principalmente la cromatografía de exclusión molecular (SEC), el reparto líquido-líquido (LLP) y la extracción en fase sólida (SPE). Estas técnicas hacen que el análisis sea muy costoso, y que requiera mucho tiempo y grandes cantidades de disolventes orgánicos. Además, durante estos procedimientos los analitos pueden contaminarse y perderse durante la manipulación de la muestra. Se ha propuesto la cromatografía de immunoafinidad (IA) como procedimiento de limpieza para la determinación de tifluzamida en muestras de cacahuete (Rejeb et al., "Development and characterization of immunoaffinity columns for the selective extraction of a new developmental pesticide: Thifluzamide, from peanuts", Anal. Chim. Acta, 2001, 432, 193-200).

Métodos alternativos, tal como la extracción con fluidos supercríticos (SFE), la extracción con líquidos presurizados o la extracción asistida por microondas (MAE), apenas se usan dado que los frutos secos son matrices complejas algunas de cuyas características tales como el tamaño de partícula, el contenido de humedad, etc., son decisivas en la eficacia de la extracción. La extracción en fase sólida (SPE) no puede usarse con frutos secos ya que la muestra debería estar en estado líquido homogéneo antes de adicionarla a un dispositivo SPE de columnas o discos. La dispersión de matriz en fase sólida (MSPD) fue introducida en 1989 por Barker et al. (Barker et al., J. Chromatrogr., 1989, 475, 353) para la ruptura y extracción simultánea de muestras sólidas y semisólidas. La MSPD supone la homogeneización y dispersión de una pequeña cantidad de matriz con material inerte de relleno (normalmente octadecil sílice, C₁₈), seguidas de la elución de los analitos con una pequeña cantidad de disolvente. Los extractos así obtenidos ya pueden ser analizados (Doréa and Lancas, "Matrix solid phase extraction of organophosphorus and synthetic pyrethroid pesticides in cashew nut and passion fruit", J. Microcolumn. Sep., 1999, 11(5), 367-375) o bien pueden ser sometidos a una etapa de limpieza antes de su análisis. La MSPD se ha usado para extraer residuos de carbamatos de muestras de almendras con una etapa posterior de limpieza mediante SPE usando alúmina y C₁₈ como material inerte de relleno de limpieza, si bien se han obtenido resultados poco satisfactorios debido a la gran cantidad de grasa presente.

A fin de resolver este problema se ha desgrasado previamente la muestra mediante hidrólisis alcalina con NaOH (Garcinuño et al., "Optimization of matrix solid-phase dispersion method with subsequent clean-up for the determination of ethylene bisdithiocarbamate residues in almond samples", J. Chromatogr. A., 2004, 1041, 35-41). Husain y colaboradores han analizado diazinón y etión en pistachos usando MSPD y cromatografía de capa fina (TLC) para la separación de plaguicidas del extracto de pistacho, seguidas de cromatografía de gases (GC) con detección de nitrógeno-fósforo (GC-NPD) (Husain et al., "Multiresidue determination of diazinon and ethion in pistachio nuts by use of matrix solid phase dispersion with a lanthanum silicate co-column and gas chromatography", Acta Chromatographica, 2003, 13, 208-214).

El grupo de investigación de los presentes inventores ha desarrollado un método sencillo, rápido y sensible para la determinación de plaguicidas organofosforados en vegetales tales como tomates, por ejemplo (Cortes et al., "Large Volume GC injection for the analysis of organophosphorus pesticides in vegetables using the Through Oven Transfer Adsorption Desorption (TOTAD) interface", J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 1997-2002). Los residuos de plaguicida se extrajeron de las muestras con una pequeña cantidad de acetato de etilo y sulfato sódico anhidro, no siendo necesarias etapas adicionales de concentración y limpieza. Los análisis se llevaron a cabo mediante inyección de grandes volúmenes en un cromatógrafo de gases empleando la interfase TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption). Este método, sin embargo, no podría aplicarse para el análisis de plaguicidas en muestras de frutos secos debido a la naturaleza grasa de la matriz.

Continúa existiendo en el estado de la técnica, por tanto, la necesidad de un procedimiento sencillo, rápido y sensible para la determinación de plaguicidas en frutos secos.

Los presentes inventores han desarrollado un nuevo método para analizar plaguicidas en muestras de frutos secos que comprende una etapa de extracción con un bajo consumo de disolvente, una etapa de cromatografía líquida y una etapa de cromatografía gaseosa, estando estas acopladas en línea mediante la interfase TOTAD.

En la cromatografía líquida-cromatografía gaseosa (LC-GC) en línea de este método, la LC separa los plaguicidas del material graso complejo y la fracción LC que contiene el plaguicida se transfiere automáticamente al cromatógrafo de gases mediante la interfase TOTAD, permitiendo así un análisis rápido, sencillo y fiable y con muy poca manipulación de la muestra.

La interfase TOTAD es un inyector con temperatura programada (PTV) modificado que permite la inyección de grandes volúmenes de disolventes, polares o apolares, en cromatografía de gases capilar así como el acoplamiento en línea de cromatografía de líquidos, tanto en fase normal como en fase inversa, y cromatografía gaseosa (RPLC-GC). Así, se ha utilizado en el análisis de residuos de plaguicidas en agua por introducción de grandes volúmenes de muestra (J. Alario et al., "Very Large Volume Sampling of Water in GC using the TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption) Interface for Pesticide Residue Analysis",...

1. Un procedimiento para analizar plaguicidas en frutos secos que comprende las etapas de:

caracterizado porque el acoplamiento entre la cromatografía líquida y la cromatografía de gases se efectúa mediante la interfase TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los frutos secos se seleccionan de entre pistachos, nueces, almendras, cacahuetes, avellanas, bellotas castañas, piñones, pipas y anacardos.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque los frutos secos son pistachos.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el disolvente de la etapa (a) se selecciona de entre diclorometano, cloroformo, acetato de etilo, éter, éter de petróleo, acetona y acetonitrilo.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el disolvente de la etapa (a) es diclorometano.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el eluyente empleado en la cromatografía líquida de la etapa (b) se selecciona de entre acetonitrilo, metanol, agua, isopropanol, n-propanol, dioxano, terc-butilmetileter y mezclas de los mismos.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque el eluyente empleado en la cromatografía líquida de la etapa (b) es una mezcla de acetonitrilo y agua.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas (b) y (c) de análisis son totalmente automáticas.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de detección del cromatógrafo de gases es un detector seleccionado entre un detector de nitrógeno-fósforo, un detector de captura electrónica, un detector de ionización de llama, un detector fotométrico de llama y un espectrómetro de masas.