Nuevos microorganismos para la producción de 1,2-propanodiol obtenidos mediante una combinación de evolución y diseño racional.

Método para la preparación de una cepa de microorganismo evolucionada para la producción de 1

,2-propanodiol a partir de una fuente de carbono, comprendiendo dicho método:

- hacer crecer una cepa inicial bajo presión selectiva en un medio de crecimiento apropiado, comprendiendo dicha cepa bacteriana una atenuación de la expresión del gen tpiA y una atenuación de la expresión de al menos uno de los genes involucrados en la conversión de metilglioxal en lactato, con el objetivo de promover la evolución de dicha cepa inicial,

- seleccionar y aislar la cepa evolucionada que presenta una tasa de producción de 1,2-propanodiol incrementada,

- reconstruir un gen tpiA funcional en la cepa evolucionada.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/053445.

Solicitante: METABOLIC EXPLORER.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: BIÔPOLE CLERMONT-LIMAGNE 63360 SAINT BEAUZIRE FRANCIA.

Inventor/es: SOUCAILLE, PHILIPPE, FIGGE, RAINER, DR., VOELKER,FRANÇOIS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P7/18 (Polioles)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/90 (Isomerasas (5.))

PDF original: ES-2525796_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Nuevos microorganismos para la producción de 1,2-propanodiol obtenidos mediante una combinación de evolución y diseño racional.

La presente divulgación se refiere a un nuevo método que combina evolución y diseño racional para la preparación de un microorganismo para producir 1,2-propanodiol, el microorganismo obtenido por el mismo y su uso para la preparación de 1,2-propanodiol.

El 1,2-propanodiol o propilenglicol, un dialcohol C3, es un producto químico ampliamente utilizado. Es un componente de resinas de poliéster ¡nsaturadas, detergentes líquidos, refrigerantes, líquidos anticongelantes y descongelantes para aviones. Desde 1993-1994 se ha incrementado el uso del propilenglicol como sustituto de derivados del etileno, los cuales han sido reconocidos como más tóxicos que los derivados del propileno.

El 1,2-propanodiol se produce actualmente por medios químicos utilizando un proceso de hidratación de óxido de propileno que consume grandes cantidades de agua. El óxido de propileno puede producirse mediante dos procesos, uno utilizando epiclorhidrina, y el otro utilizando hidroperóxido. Ambas rutas utilizan sustancias altamente tóxicas. Adicionalmente, la ruta del hidroperóxido genera subproductos tales como el fe/f-butanol y el 1-feniletanol. Para que la producción de propileno resulte rentable se debe encontrar un uso para estos subproductos. Generalmente la ruta química produce 1,2-propanodiol racémico, mientras que cada uno de los dos estereoisómeros

(R) 1,2-propanodiol y (S) 1,2-propanodiol es de interés para una serie de aplicaciones (por ejemplo compuestos quirales iniciales para productos químicos especiales y productos farmacéuticos).

Las desventajas de los procesos químicos para la producción de 1,2-propanodiol hacen que la síntesis biológica sea una alternativa atractiva. Dos rutas han sido caracterizadas para la producción natural de 1,2-propanodiol a partir de azúcares por microorganismos.

En la primera ruta, azúcares 6-deox¡ (por ejemplo L-ramnosa o L-fucosa) se escinden en dihidroxiacetona fosfato y

(S) -lacto-aldehído, que puede ser reducido más delante a 1,2-propanodiol (Badia et al, 1985). Esta ruta es funcional en E.coli pero su rendimiento no permite un proceso rentable económicamente debido al elevado coste de las

deoxihexosas.

La segunda ruta es el metabolismo de azúcares comunes (por ejemplo glucosa o xilosa) a través de la vía de la gllcóllsls, seguida de la vía metilglioxal. La dihidroxiacetona fosfato se convierte en metilglioxal, el cual puede ser reducido ya sea a lacto-aldehído o bien a acetol. Estos dos compuestos pueden someterse a una segunda reacción de reducción produciéndose 1,2-propanodiol Esta ruta es muy utilizada por productores naturales de propanodiol tales como Clostriduim sphenoides y Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. Clostriduim sphenoides ha sido utilizado para producir 1,2-propanodiol a títulos de 1,58 g/l en condiciones limitantes de fosfato (Tran Din and Gottschalk, 1985). Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum también ha sido investigado para la producción de 1,2-propanodiol (Cameron and Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al, 1987). Los mejores resultados obtenidos fueron un título de 9 g/l y un rendimiento a partir de glucosa de ,2 g/g. Sin embargo, la mejora de los resultados obtenidos con estos microorganismos es probable que este limitada debido a la falta de herramientas genéticas.

Antecedentes de la técnica

La solicitud de patente WO 24/33646 hace referencia a modificaciones genéticas en Escherichia coli para mejorar la producción endógena de 1,3 propanodiol, en particular la regulación a la baja del gen gapA.

Cameron et al (1998) han Investigado el uso de £. coli como plataforma de Ingeniería metabólica para la conversión de azúcares a 1,2-propanodiol. Su análisis teórico mostró que el límite superior realista del rendimiento de producto (considerando los balances de masa y la producción de energía para el crecimiento) es significativamente diferente dependiendo de las condiciones de cultivo. Bajo condiciones anaeróbicas, el acetato se producirá como un subproducto para reciclar los cofactores reducidos y el mejor rendimiento debería limitarse a 1 mol de 1,2- propanodiol por mol de glucosa (,42/g/g). Bajo condiciones aeróbicas, el reciclaje de los cofactores debe garantizarse gracias a la cadena respiratoria utilizando oxígeno como aceptor final de electrones y podría ser posible producir 1,2-propanodiol sin la producción de productos secundarios. Bajo estas condiciones, el rendimiento podría alcanzar 1,42 mol/mol (,6 g/g) en el mejor de los casos. En relación con el título máximo de 1,2-propanodiol, Cameron et al discuten su dependencia de la toxicidad del producto y de los subproductos. El 1,2-propanodiol es significativamente menos tóxico que el 1,3-propanodiol y £. coli presenta una tasa de crecimiento residual de ,5 h'1 en presencia de 1 g/l de 1,2-propanodiol. La inhibición del crecimiento es más probable que se deba al subproducto acetato, que es conocido por ser altamente inhibidor del crecimiento. El desarrollo de un proceso anaeróbico para la producción de 1,2-propanodiol con títulos y rendimientos altos tendrá que abordar el problema del acetato. Se ha propuesto la conversión de acetato en acetona, que es menos inhibidora y se elimina fácilmente in situ (WO 25/73364).

Varias investigaciones sobre modificaciones genéticas de E. coli para obtener un productor de 1,2-propanodiol que utilice fuentes de carbono simples han sido realizadas por el grupo de Cameron (Cameron et al, 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and Cameron, 2) y por el grupo de Bennett (Huang et al, 1999, Berrios-Rivera et al, 23). Estos estudios se basan, por un lado, en la expresión de una o varias actividades enzimáticas de la ruta de dlhldroxlacetona fosfato a 1,2-propanodlol y, por otro lado, en la eliminación de rutas consumidoras de NADH y de carbono en la cepa huésped. Los mejores resultados obtenidos por el grupo de Cameron son la producción de 1,4 g/l de 1,2-propanodiol en cultivo anaeróbico en frascos con un rendimiento de ,2 g/ g de glucosa consumida. Extrapolada a un termentador de lote alimentado (del inglés fed-batch) anaeróbico, la producción fue de 4,5 g/l de 1,2-propanodiol con un rendimiento de ,19 g/ g de glucosa, lejos de la evaluación teórica de Cameron et al. Estos resultados se obtuvieron con la sobreexpresión del gen de la metilglioxal sintasa de E. coli (mgs), el gen de la glicerol deshidrogenasa de £. coli (gldA) y el gen de la 1,2-propanodiol oxidoreductasa de E. coli (fucO) en una cepa careciente del gen que codifica para la lactato deshidrogenasa (IdhA). Los resultados obtenidos mediante el mismo enfoque pero con títulos y rendimientos más bajos también están descritos en las patentes US 6.87.14, US 6.33.352, y WO 98/3724.

El grupo de Bennett también utilizó una cepa huésped de £. coli careciente de IdhA para la sobreexpresión del gen mgs de Clostridium acetobutylicum y del gen gldA de £. coli. Cultivos en frasco bajo condiciones anaeróbicas dieron un título de 1,3 g/l y un rendimiento de ,12 g/g mientras que cultivos microaeróbicos dieron un titulo de 1,4 g/l y un rendimiento de ,13 g/g.

Un método alternativo para obtener una cepa productora de 1,2-propanodiol consiste en dirigir la evolución de una cepa Inicial hacia un estado en el que la cepa evolucionada produce el compuesto deseado con mejores características. Este método se basa en la evolución natural de un microorganismo que se modifica inicialmente mediante la atenuación de dos genes, el tpiA y un gen Involucrado en la conversión de metilglioxal en lactato. El objetivo de atenuar el gen tpiA que codifica para la trlosa fosfato isomerasa es separar las dos ramas metabólicas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para la preparación de una cepa de microorganismo evolucionada para la producción de 1,2-propanodiol a partir de una fuente de carbono, comprendiendo dicho método:

hacer crecer una cepa inicial bajo presión selectiva en un medio de crecimiento apropiado, comprendiendo dicha cepa bacteriana una atenuación de la expresión del gen tpiA y una atenuación de la expresión de al menos uno de los genes involucrados en la conversión de metilglioxal en lactato, con el objetivo de promover la evolución de dicha cepa inicial,

seleccionar y aislar la cepa evolucionada que presenta una tasa de producción de 1,2-propanodiol incrementada,

reconstruir un gen tpiA funcional en la cepa evolucionada.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el gen involucrado en la conversión de metilglioxal a lactato se selecciona de entre el grupo que consiste en: gloA, a/dAy aldB y combinaciones de los anteriores.

3. Método según las reivindicaciones 1 o 2, en el que la cepa inicial comprende asimismo la atenuación de la expresión de al menos uno de los genes seleccionados de entre el grupo que consiste en IdhA, pflA, pflB, adhE, edd y eda.

4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que además la cepa inicial comprende la atenuación de al menos uno de los genes seleccionados de entre el grupo que consiste en arcA y ndh.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que la cepa evolucionada se selecciona y se aísla en base a su tasa de producción de 1,2-propanodiol, incrementada en al menos 2% en comparación con la tasa de producción de la cepa inicial.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la cepa inicial se selecciona de entre el grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la cepa inicial se selecciona de entre el grupo que consiste en Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la cepa inicial es Escherichia coli o Clostridium acetobutylicum.