Desarrollo de mutaciones útiles para atenuar virus del dengue y virus del dengue quiméricos.

Virus del dengue que comprende mutaciones de alanina en las posiciones aminoacídicas que corresponden a las posiciones aminoacídicas 2923 y 2924 de la SEQ ID NO: 19

.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10181786.

Solicitante: THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: Office of Technology Transfer, National Institutes of Health, Suite 325, 6011 Executive Boulevard Rockville, MD 20852-3804 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MURPHY, BRIAN, R., LAI, CHING-JUH, WHITEHEAD,STEPHEN,S, HANLEY,KATHRYN A, BLANEY,JOSEPH E. JR.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K1/00 (Procedimientos generales de preparación de péptidos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K14/00 (Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K17/00 (Péptidos fijados sobre un soporte o inmovilizados; Su preparación)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los... > C12N7/04 (Inactivación o atenuación; Producción de partes elementales de virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N7/00 (Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/12 (Antígenos virales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/02 (con ribosilo como radical sacárido)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/04 (con desoxirribosilo como radical sacárido)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los... > C12N7/01 (Virus, p. ej. Bacteriófagos, modificados por la introducción de material genético externo (vectores C12N 15/00))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/42 (virales)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/295 (Antígenos virales polivalentes (virus de la viruela o de la varicela A61K 39/285 ); Mezclas de antígenos virales y bacterianos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/48 (Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos que contienen radicales... > C12P19/34 (Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/70 (en los que intervienen virus o bacteriófagos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/193 (Virus de encefalomielitis equina)

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Desarrollo de mutaciones útiles para atenuar virus del dengue y virus del dengue quiméricos.

Fragmento de la descripción:

Desarrollo de mutaciones útiles para atenuar virus del dengue y virus del dengue quiméricos Campo de la invención Se desarrolló un menú de mutaciones que es útil en el ajuste de las características de atenuación y crecimiento de vacunas del virus del dengue.

Antecedentes de la invención El virus del dengue es un virus de ARN de sentido positivo que pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae. El virus del dengue está ampliamente distribuido en todas las regiones tropicales semitropicales del mundo y se transmite a los seres humanos por mosquitos vectores. El virus del dengue es una causa principal de hospitalización y muerte en niños en al menos ocho países asiáticos tropicales (WHO, 1997. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment prevention and control -2ª ed. Geneva: WHO) . Existen cuatro serotipos del virus del dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4) que anualmente provocan 50 -100 millones de casos estimados de fiebre por dengue y 500.000 casos de la forma más grave de la infección por el virus del dengue, fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue (DHF/DSS) (Gubler, D.J. & Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53:35-70) . La DHF/DSS se ve predominantemente en niños y en adultos que experimentan una segunda infección por el virus del dengue con un serotipo diferente al de su primera infección por el virus del dengue y en una infección principal en lactantes que aún tienen anticuerpos maternos específicos del dengue en circulación (Burke, D.S. et al. 1988 Am JTrop Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-72) . Se necesita una vacuna para disminuir el grado de enfermedad provocada por el virus del dengue, pero no está disponible ninguna. Debido a la asociación de una enfermedad más grave con una infección por el virus del dengue secundaria, una vacuna exitosa debe inducir inmunidad para los cuatro serotipos. La inmunidad está mediada principalmente por un anticuerpo neutralizante dirigido contra la glucoproteína E de la envoltura, una proteína estructural viriónica. La infección con un serotipo induce inmunidad homotípica de larga duración y una inmunidad heterotípica de corta duración (Sabin, A. 1955 Amer J Trop Med Hyg 4:198-207) . Por lo tanto, el objetivo de la inmunización es inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes de larga duración contra DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4, que se puede lograr mejor económicamente usando vacunas de virus vivos atenuados. Este es un objetivo razonable puesto que ya se ha desarrollado una vacuna atenuada para el virus de la fiebre amarilla relacionado, otro flavivirus transmitido por mosquitos presente en regiones tropicales y semitropicales del mundo (Monath, T.P. & Heinz, F.X. 1996 en: Fields B.N. et al. eds. Fields Virology Philadelphia: Lippincott-Ravan Publishers, 961-1034) .

Se han desarrollado y evaluado varios candidatos a vacunas del dengue vivo atenuado en seres humanos o en primates no humanos. Los primeros candidatos a vacunas del dengue vivo atenuado fueron mutantes de la gama de huéspedes desarrollados por el paso en serie de virus del dengue naturales en los cerebros de ratones y la selección de mutantes atenuados para seres humanos (Kimura, R. & Hotta, S. 1944 Japanese J Bacteriology 1:9699; Sabin, A.B. & Schlesinger, R.W. 1945 Science 101:640; Wisseman, C.L. Jr. et al. 1963 Am J Trop Med 12:620623) . Aunque estos virus de vacunas candidatas fueron inmunógenos en seres humanos, su escaso crecimiento en cultivo celular evitó un desarrollo posterior. Se han desarrollado candidatos a vacunas de DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4 vivos atenuados adicionales por el paso en serie en cultivo de tejidos (Angsubhakorn, S. et al. 1994 Southeast Asian J Trop Med Public Health 25:554-9; Bancroft, W.H. et al. 1981 Infect Immun 31:698-703; Bhamarapravati, N. et al. 1987 Bull World Health Organ 65:189-95; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Hoke, C.H. Jr. et al. 1990 Am J Trop Med Hyg 43:219-26; Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:317988) o por mutagénesis química (McKee, K.T. Jr. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-42) . Se ha demostrado que es muy difícil lograr un equilibrio satisfactorio entre la atenuación y la inmunogenicidad para cada uno de los cuatro serotipos del virus del dengue usando estos enfoques y formular una vacuna tetravalente que sea segura e inmunógena de forma satisfactoria contra cada uno de los cuatro virus del dengue (Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-88; Bhamarapravati, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18 Supl 2: 44-7) .

Recientemente dos avances principales que utilizan tecnología de ADN recombinante han hecho posible el desarrollo de candidatos a vacunas del virus del dengue atenuado vivo prometedores adicionales. En primer lugar, se han desarrollado procedimientos para recuperar virus del dengue infecciosos a partir de células transfectadas con transcritos de ARN derivados de un clon de ADNc de longitud completa del genoma del virus del dengue, haciendo posible de este modo derivar virus infecciosos que llevan mutaciones atenuantes que se han introducido en el clon de ADNc por mutagénesis dirigida a sitio (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-43) . En segundo lugar, es posible producir virus quiméricos antigénicos en los que la región codificante de proteína estructural del clon de ADNc de longitud completa se reemplaza por la de un serotipo del virus del dengue diferente o de un flavivirus más divergente (Bray, M. & Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88: 10342-6; Chen, W. et al. 1995 J Virol 69:5186-90; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8; Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS USA 95:1746-51) . Estas técnicas se han usado para construir virus del dengue quiméricos intertípicos que han demostrado que son eficaces en la protección de monos contra un desafío de virus del dengue homólogo (Bray, M. et al. 1996 J Virol 70:4162-6) . A pesar de estos avances, existe una necesidad de desarrollar vacunas de virus del dengue atenuado antigénicas que especifiquen un equilibrio

satisfactorio ente la atenuación y la inmunogenicidad para los seres humanos.

Sumario de la invención La invención proporciona lo siguiente:

1. Un virus del dengue que comprende mutaciones de alanina en las posiciones aminoacídicas que corresponden a las posiciones aminoacídicas 2923 y 2924 de la SEQ ID NO: 19.

2. El virus del dengue del punto 1, que comprende adicionalmente la mutación Δ30.

3. El virus del dengue del punto 1, en el que el virus del dengue es un virus del dengue de tipo 1, un virus del dengue de tipo 2, un virus del dengue de tipo 3 o un virus del dengue de tipo 4.

4. El virus del dengue del punto 1, en el que el virus del dengue es un virus quimérico.

5. El virus quimérico del punto 4 que tiene un esqueleto de dengue 1, un esqueleto de dengue 2, un esqueleto de dengue 3, o un esqueleto de dengue 4.

6. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con cualquiera de los puntos 1-5.

7. Un kit que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con el punto 6 en un envase o dispositivo dispensador e instrucciones para su administración.

8. Un uso de un virus del dengue de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de una composición farmacéutica para producir anticuerpos neutralizantes contra el virus del dengue, en el que dicha composición se va a administrar a un sujeto.

9. Composición farmacéutica que comprende un virus del dengue de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para usar en producir anticuerpos neutralizantes contra el virus del... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Virus del dengue que comprende mutaciones de alanina en las posiciones aminoacídicas que corresponden a las posiciones aminoacídicas 2923 y 2924 de la SEQ ID NO: 19.

2. El virus del dengue de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la mutación Δ30.

3. El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus del dengue de tipo 1, un virus del dengue de tipo 2, un virus del dengue de tipo 3 o un virus del dengue de tipo 4.

4. El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus quimérico.

5. El virus quimérico de la reivindicación 4 que tiene un esqueleto de dengue 1, un esqueleto de dengue 2, un esqueleto de dengue 3, o un esqueleto de dengue 4.

6. Composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Kit que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 en un envase o dispositivo dispensador e instrucciones para su administración.

8. Uso de un virus del dengue de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de una composición farmacéutica para producir anticuerpos neutralizantes contra el virus del dengue, en el que dicha composición se va a administrar a un sujeto.

9. Composición farmacéutica que comprende un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para usar en producir anticuerpos neutralizantes contra el virus del dengue, en el que dicha composición se va a administrar a un sujeto.

10. El uso de la reivindicación 8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 9, en los que la administración es por inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular.

11. Vacuna tetravalente que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

12. Vacuna viva atenuada que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

13. La vacuna viva atenuada de la reivindicación 12 en forma de dosificación unitaria que tiene desde aproximadament.

10. 109 unidades formadoras de placa (PFU) /ml.

14. Vacuna inactivada que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

15. La vacuna inactivada de la reivindicación 14 en forma de dosificación unitaria que tiene desde aproximadamente 0, 1 hasta 50 μg de proteína E/ml.

16. Molécula de ácido nucleico que codifica un virus del dengue de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15, en la que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADNc o una molécula de ARN.

17. Procedimiento de preparación de un virus del dengue que comprende (a) sintetizar ARN genómico vírico de longitud completa in vitro usando una molécula de ADNc que codifica un virus del dengue de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5; (b) transfectar células cultivadas con el ARN genómico vírico para producir virus; y (c) aislar el virus de las células cultivadas.

0, 01 0, 01

DEN4 2A

Mutagénesis de 5-FU 1 mM en células Vero Disminución de 100 veces en el valor vírico Dilución terminal 1x

1.248 clones de virus viables en células Vero Cribado para fenotipo ts Células Vero Células HuH-7 (riñón de mono) (hepatoma humano)

Dilución terminal 2x Confirmación de fenotipos

ts en ambas células: 13 clones de virus ts solo en HuH-7: 7 clones de virus Figura 2