Secuenciación de ADN.

Un procedimiento para secuenciar un ácido nucleico diana usando un procedimiento de secuenciación por síntesis (SBS),

comprendiendo el procedimiento:

a) proporcionar una primera pluralidad de una primera base de nucleótidos, una segunda pluralidad de una segunda base de nucleótidos, una tercera pluralidad de una tercera base de nucleótidos, y una cuarta pluralidad de una cuarta base de nucleótidos;

en el que una primera fracción de la primera pluralidad de la primera base de nucleótidos está marcada con un marcador, una segunda fracción de la segunda pluralidad de la segunda base de nucleótidos está marcada con dicho marcador, una tercera fracción de la tercera pluralidad de la tercera base de nucleótidos está marcada con un marcador y una cuarta fracción de la cuarta pluralidad de la cuarta base de nucleótidos está marcada con un marcador, y

en el que el grado de marcaje difiere para la primera pluralidad de la primera base de nucleótidos y la segunda pluralidad de la segunda base de nucleótidos de manera que dicha primera fracción es diferente de dicha segunda fracción;

b) incorporar por polimerización la primera pluralidad de la primera base de nucleótidos, la segunda pluralidad de la segunda base de nucleótidos, la tercera pluralidad de la tercera base de nucleótidos o la cuarta pluralidad de la cuarta base de nucleótidos en una pluralidad de copias de un ácido nucleico que es complementario al ácido nucleico diana;

c) detectar una amplitud de una señal producida a partir de la primera pluralidad de la primera base de nucleótidos, o una amplitud de una señal producida a partir de la segunda pluralidad de la segunda base de nucleótidos, o una amplitud de una señal producida a partir de la tercera pluralidad de la tercera base de nucleótidos, o una amplitud de una señal producida a partir de la cuarta pluralidad de la cuarta base de nucleótidos en la pluralidad de copias del ácido nucleico que es complementaria al ácido nucleico diana, en el que la amplitud producida por la primera pluralidad de la primera base de nucleótidos es detectablemente diferente de una segunda amplitud producida por la segunda pluralidad de la segunda base de nucleótidos y en el que el grado de marcaje de la primera base de nucleótidos está directamente asociado con la intensidad de la señal producida para la primera base de nucleótidos y el grado de marcaje de la segunda base de nucleótidos está directamente asociado con la intensidad de la señal producida para la segunda base de nucleótidos; y

d) asociar la amplitud de la señal con la primera base de nucleótidos o la segunda base de nucleótidos, o la tercera base de nucleótidos, o la cuarta base de nucleótidos para identificar la base de nucleótidos en la pluralidad de copias de un ácido nucleico que es complementario al ácido nucleico diana,

y en el que el procedimiento de SBS es un enfoque de secuenciación basado en conjunto y la secuencia del ácido nucleico diana se determina detectando una intensidad de señal después de la incorporación de cada base y asociando las intensidades con las bases,

en el que:

(i) cada uno de los nucleótidos comprende un grupo hidroxilo en 3' que está bloqueado químicamente y los cuatro nucleótidos se añaden simultáneamente a una reacción que comprende ADN polimerasa y racimos de complejos molde-cebador; o

(ii) cada nucleótido se añade de uno en uno a una mezcla de reacción que contiene un complejo de ácido nucleico diana-cebador y una polimerasa.