Un procedimiento para sintetizar un dominio sencillo-grupo efector (dAb-grupo efector) adecuado para uso in vivo,

que comprende las etapas de:

(a) seleccionar un dominio variable sencillo de anticuerpo que tiene una especificidad de unión a epítope; y

(b) unir el dominio sencillo de la etapa (a) a una o más regiones constantes de anticuerpo y/o una región de bisagra (un grupo efector), n el que el domino variable sencillo de anticuerpo es un dominio variable de cadena ligera

Fusión de Fc con dAb de V_L.

La presente invención se refiere a un procedimiento sencillo para generar moléculas de anticuerpo adecuadas para su uso in vivo. En particular, la invención se refiere a un procedimiento para la generación de moléculas de anticuerpo adecuadas para su uso in vivo que se basan en dominios variables sencillos de anticuerpo.

Introducción

El dominio de unión antígeno de un anticuerpo comprende dos regiones separadas: un dominio variable de cadena pesada (V_H) y un dominio variable de cadena ligera (V_L: que puede ser V_?V_? o V_?). El propio sitio de unión a antígeno está formado por seis bucles polipeptídicos: tres del dominio V_H (H1, H2 y H3) y tres del dominio V_L (L1, L2 y L3). Un repertorio primario diverso de genes de V que codifican los dominios V_H y V_L se produce por la reorganización combinatoria de segmentos génicos. El gen de V_H se produce por la recombinación de tres segmentos génicos, V_H, D y J_H. En seres humanos, existen aproximadamente 51 segmentos V_H funcionales (Cook y Tomlinson (1995) Immunol Today, 16: 237), 25 segmentos D funcionales (Corbett y col. (1997) J. Mol. Biol., 268: 69) y 6 segmentos J_H funcionales (Ravetch y col. (1981) Cell, 27: 583), dependiendo del haplotipo. El segmento V_H codifica la región de la cadena polipeptídica que forma el primer y segundo bucles de unión a antígeno del domino V_H (H1 y H2), mientras que los segmentos V_H, D y J_H se combinan para formar el tercer bucle de unión a antígeno del dominio V_H (H3). El gen de V_L se produce por recombinación de sólo dos segmentos génicos, V_L y J_L. En seres humanos, existen aproximadamente 40 segmentos V_? funcionales (Schäble y Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001), 31 segmentos V_? funcionales (Williams y col. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki y col. (1997) Genome Res., 7: 250), 5 segmentos J_? funcionales (Hieter y col. (1982) J. Biol. Chem., 257: 1516) y 4 segmentos J_? funcionales (Vasicek y Leder (1990) J. Exp. Med., 172: 609) dependiendo del haplotipo. El segmento V_L codifica la región de la cadena polipeptídica que forma el primer y segundo bucles de unión a antígeno del domino V_L (L1 y L2), mientras que los segmentos V_L y J_L se combinan para formar el tercer bucle de unión a antígeno del domino V_L (L3). Se cree que los anticuerpos seleccionados de este repertorio primario son suficientemente diversos para unirse a casi todos los antígenos con una afinidad al menos moderada. Se producen anticuerpos de alta afinidad por "maduración de afinidad" de los genes reorganizados, en los que se generan mutaciones puntuales y se seleccionan por el sistema inmune basándose en una unión mejorada.

El análisis de las estructuras y secuencias de anticuerpos ha demostrado que cinco de los seis bucles de unión a antígeno (H1, H2, L1, L2, L3) poseen un número limitado de conformaciones de cadena principal o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia y col. (1989) Nature, 342: 877). Las conformaciones de cadena principal se determinan por (i) la longitud del bucle de unión a antígeno y (ii) restos particulares, o tipos de restos, en cierta posición clave en el bucle de unión a antígeno y la región flanqueante de anticuerpo. El análisis de las longitudes de bucle y restos clave ha permitido predecir a los presentes inventores las conformaciones de cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 codificadas por la mayoría de secuencias de anticuerpos humanas (Chothia y col. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson y col. (1995) EMBO J., 14: 4628; William y col. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en términos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), también forma un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes de bucle cortas que dependen de la longitud y de la presencia de restos particulares, o tipos de restos, en posiciones clave en el bucle y la región flanqueante de anticuerpo (Martin y col. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai y col. (1996) FEBS Letters, 399: 1).

Históricamente, se han obtenido anticuerpos a partir de fuentes naturales tales como por inmunización de conejos y otros animales de este tipo. Como alternativa, pueden emplearse técnicas de biología molecular y pueden generarse anticuerpos usando técnicas tales como las que implican el uso de hibridomas híbridos.

De este modo, pueden generarse anticuerpos de una especificidad de unión a antígeno seleccionada o deseada. Dichos anticuerpos son de gran valor terapéutico ya que pueden diseñarse, por ejemplo, contra antígenos patológicos. Sin embargo, el procedimiento de producción de estos anticuerpos es laborioso y con tendencia a errores, además de estar limitado a la diversidad resultante de la historia de inmunización del donante. Sería una ventaja generar una mayor diversidad, por ejemplo, usando bibliotecas sintéticas. Por lo tanto, continúa existiendo en la técnica la necesidad de un procedimiento sencillo para generar moléculas de anticuerpo funcionalmente activas de una especificidad de unión a antígeno deseada o predeterminada.

Se han descrito dominios variables de cadena pesada sencillos, derivados de anticuerpos naturales que normalmente comprenden cadenas ligeras, a partir de anticuerpos monoclonales o de repertorios de dominios (documento EP-A-0368684). Estos dominios variables de cadena pesada se ha demostrado que interaccionan específicamente con uno o más antígenos (Ward y col.). Sin embargo, estos dominios sencillos se ha demostrado que tienen una semivida in vivo muy corta. Por lo tanto, dichos dominios son de un valor terapéutico limitado.

Además, el documento EP 0 656 946 A1 describe moléculas de inmunoglobulina de doble cadena que se unen a antígeno específicamente y en las que las cadenas polipeptídicas pesadas están desprovistas de dominios de cadena pesada CH1, estando también la inmunoglobulina desprovista de cadenas polipeptídicas ligeras. Dichos anticuerpos son de origen natural en camélidos y, por lo tanto, como tales, la especificidad de antígeno del anticuerpo está limitada a la generada por el camélido.

También son dignos de atención estudios realizados sobre la Enfermedad de Cadenas Pesadas. En esta enfermedad se generan moléculas de inmunoglobulina que comprenden un dominio variable de cadena pesada, dominios CH2 y CH3, pero carecen de un domino CH1 y de cadenas ligeras. Se ha descubierto que dichas moléculas se acumulan en la Enfermedad de Cadenas Pesadas (Block y col, Am J. Med, 55,61-70 (1973), Ellman y col, New Engl. J. Med, 278: 95-1201 (1968)). Por lo tanto, la técnica anterior de la Enfermedad de Cadenas Pesadas enseña que los anticuerpos que comprenden un solo tipo de dominio de interacción con antígeno sencillo (en este caso, dominios variables de cadena pesada) están asociados con la enfermedad. Es decir, la técnica anterior está lejos de enseñar el uso de anticuerpos basados únicamente en dominios variables de cadena pesada humana para uso profiláctico y/o terapéutico.

La solicitud de patente internacional WO88/09344 (Creative Biomolecules) describe construcciones de anticuerpo que comprenden engarces para unir dominios.

El documento EP-A-0368684 describe un ligando de dominio sencillo constituido por al menos parte del dominio variable de una cadena de una molécula de la superfamilia de las inmunoglobulinas.

El documento US 6.248.516 se refiere a una biblioteca para la expresión de dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina (dominios VH), comprendiendo dicha biblioteca un repertorio de secuencias de ácido nucleico que codifican una tercera CDR de un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina.

El documento WO 02/085945 describe un procedimiento para la producción de un anticuerpo de cadena pesada sencilla VHH en un mamífero, que comprende la etapa de expresar un locus de cadena pesada VHH heterólogo en ese mamífero.

El documento WO 94/04678 describe una inmunoglobulina que comprende dos cadenas polipeptídicas pesadas suficientes para la formulación de un sitio de unión a antígeno completo o varios sitios de unión a antígeno, estando la inmunoglobulina desprovista además de cadenas polipeptídicas ligeras.

El documento US 5.869.046 describe...

1. Un procedimiento para sintetizar un dominio sencillo-grupo efector (dAb-grupo efector) adecuado para uso in vivo, que comprende las etapas de:

(a) seleccionar un dominio variable sencillo de anticuerpo que tiene una especificidad de unión a epítope; y

(b) unir el dominio sencillo de la etapa (a) a una o más regiones constantes de anticuerpo y/o una región de bisagra (un grupo efector), n el que el domino variable sencillo de anticuerpo es un dominio variable de cadena ligera.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio variable de cadena ligera es un miembro del subgrupo de dominios V_k.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio variable de cadena ligera es un miembro del subgrupo de dominios V_?.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el grupo efector comprende uno cualquiera o más de los grupos seleccionados del grupo constituido por: una región constante de cadena ligera de anticuerpo (C_L), un dominio de cadena pesada CH1 de anticuerpo, un dominio de cadena pesada CH2 de anticuerpo, un dominio de cadena pesada CH2 de anticuerpo, un dominio de cadena pesada CH3 de anticuerpo, una región Fc de un anticuerpo y una región de bisagra de una molécula de anticuerpo.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el grupo efector constituye una región Fc de un anticuerpo.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el grupo efector está constituido por un dominio CH2 y CH3.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el grupo efector está constituido por un dominio CH2, un dominio CH3 y la región de bisagra de una molécula de anticuerpo.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable sencillo de anticuerpo es un dominio variable que no es de camélido.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable sencillo de anticuerpo comprende una o más regiones flanqueantes humanas.

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable sencillo de anticuerpo comprende cuatro regiones flanqueantes, según se definen por Kabat, que proceden de un ser humano.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que una o más de las regiones flanqueantes humanas definidas por Kabat son idénticas a nivel de los aminoácidos a las codificadas por genes de anticuerpo de la línea germinal humana.

12. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable sencillo de anticuerpo es un dominio variable humano.

13. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable sencillo de anticuerpo no se ha generado en un animal.

14. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable sencillo de anticuerpo se une al superantígeno proteína L.

15. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el grupo efector es de origen humano o de camélido.

16. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable sencillo comprende uno o más regiones flanqueantes humanas y el grupo efector de inmunoglobulina es de origen humano.

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el dominio variable sencillo comprende cuatro regiones flanqueantes humanas y el grupo efector de inmunoglobulina es de origen humano.

18. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la unión del dominio variable sencillo al grupo efector en la etapa (b) se efectúa por expresión del dominio sencillo-grupo efector como un polipéptido de fusión.

19. Un dAb-grupo efector adecuado para uso in vivo, que comprende un dominio variable sencillo de anticuerpo que tiene una especificidad de unión a epítope unido a una o más regiones constantes de anticuerpo y/o una región de bisagra (un grupo efector), en el que el dominio variable sencillo de anticuerpo es un dominio variable de cadena ligera.

20. Un dAb-grupo efector para su uso como un medicamento, en el que dAb es un dominio variable sencillo de cadena ligera y el grupo efector es una o más regiones constantes de anticuerpo y/o región de bisagra.

21. Un dAb-grupo efector de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el dominio variable de cadena ligera es un miembro del subgrupo de dominios V_k.

22. Un dAb-grupo efector de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el dominio variable de cadena ligera es un miembro del subgrupo de dominios V_?.

23. Un dAb-grupo efector de acuerdo con las reivindicaciones 19 a 22, en el que el grupo efector comprende uno cualquiera o más de los grupos seleccionados del grupo constituido por: una región constante de cadena ligera de anticuerpo (C_L) y dominio de cadena pesada CH1 de anticuerpo, y dominio de cadena pesada CH2 de anticuerpo, un dominio de cadena pesada CH3 de anticuerpo, una región Fc de un anticuerpo y una región de bisagra de una molécula de anticuerpo.

24. Un dAb-grupo efector de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el grupo efector está constituido por un dominio CH2 y CH3.

25. Un dAb-grupo efector de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el grupo efector está constituido por un dominio CH2, un dominio CH3 y la región de bisagra de una molécula de anticuerpo.

26. Un dAb-grupo efector de acuerdo con las reivindicaciones 20 a 23, en el que el grupo efector constituye una región Fc de un anticuerpo.

27. Un dAb-grupo efector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, en el que el dominio variable sencillo de anticuerpo comprende regiones flanqueantes humanas.

28. Un dAb-grupo efector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, en el que el dominio variable de cadena sencilla de anticuerpo es de origen humano.

29. Un dAb-grupo efector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28, en el que grupo efector es de origen humano o de camélido.

30. Un dAb-grupo efector de acuerdo con cualquier a de las reivindicaciones 19 a 29, en el que el dominio variable sencillo comprende una o más regiones flanqueantes humanas y el grupo efector de inmunoglobulina es de origen humano.

31. Dos o más dAb-grupos efectores que comprenden al menos un dAb-grupo efector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 31, proporcionado como una estructura de orden superior seleccionada del grupo constituido por los siguientes: dímeros, trímeros y multímeros.

32. Dos dAb-grupos efectores de acuerdo con la reivindicación 31, proporcionados como un heterodímero o un homodímero.

33. Dos dAb-grupos efectores de acuerdo con la reivindicación 32, proporcionados como un homodímero.

34. Una composición que comprende un dAb-grupo efector para su uso como un medicamento, en la que dAb-grupo efector se describe por cualquiera de las estructuras mostradas en la Figura 1 (b) y (g), en la que 1=VL y VL es un dAb de VL.

35. Una composición que comprende un dímero de dAb-grupos efectores como se describe en la reivindicación 34.

36. Una molécula de ácido nucleico que codifica al menos un dAb-grupo efector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 35.

37. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 36, que codifica además una secuencia de señal para la exportación del dAb y del grupo efector desde el citoplasma de una célula huésped tras su expresión.

38. Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 36 o la reivindicación 37.

39. Una célula huésped transfectada con un vector de acuerdo con la reivindicación 38.

40. Una composición que comprende un dAb-grupo(s) efector(es) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 35 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

41. Una composición de acuerdo con la reivindicación 40, que tiene un t^1/2 alfa de 15 minutos o más.

42. Una composición de acuerdo con al reivindicación 40, que tiene un t^1/2 alfa de 1 a 6 horas.

43. Una composición de acuerdo con la reivindicación 40, 41 ó 42, que tiene un t^1/2 beta de 2,5 horas o más.

44. Una composición de acuerdo con la reivindicación 43, que tiene un t^1/2 beta de 1 día o más.

45. Una composición de acuerdo con la reivindicación 43, que tiene un t^1/2 beta de 2 días o más.

46. Una composición de acuerdo con la reivindicación 43, que tiene un t^1/2 beta de 3 días o más.

47. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 46 que tiene un ABC de 1 mg.min/ml o más.

48. Una composición de acuerdo con la reivindicación 47 que tiene un ABC de 15 a 150 mg.min/ml.

49. El uso de un dAb-grupo efector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 33, o de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 36, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad; en el que el dominio variable sencillo de anticuerpo (dAb) es un dominio variable de cadena ligera.

50. El uso de un dAb-grupo efector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 33, o de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 35, en la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o prevención de una enfermedad inflamatoria en un paciente; en el que el dominio variable sencillo de anticuerpo (dAb) es un dominio variable de cadena ligera.

51. El uso de acuerdo con la reivindicación 50, en el que la enfermedad inflamatoria está mediada por TNF alfa y se selecciona del grupo constituido por las siguientes: artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), esclerosis múltiple, choque séptico, enfermedad de Alzheimer, trombosis coronaria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y nefritis glomerular.

52. El uso de acuerdo con la reivindicación 51, en el que la enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide.

53. El uso de acuerdo con la reivindicación 52, en el que el dominio variable sencillo de cadena ligera de anticuerpo (dAb) se une específicamente a TNF alfa.

54. El uso de un dAb-grupo efector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 33 o de una composición de acuerdo con la reivindicación 34 o 35 en la preparación de un medicamento para reducir y/o prevenir y/o suprimir la caquexia en un paciente.

55. Uso de acuerdo con la reivindicación 54, en el que la caquexia está mediada por TNF alfa humano y el paciente es un ser humano.

56. Uso de acuerdo con la reivindicación 54-55, en el que el grupo efector es Fc.

57. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 56, en el que el dAb-grupo efector se administra en un intervalo de dosificación de 0,5 a 20 mg/kg.

58. Uso de acuerdo con la reivindicación 57, en el que el dAb-grupo efector se administra en una dosis de intervalo de 1 a 10 mg/kg.

59. Una composición de acuerdo con la reivindicación 34 que tiene la estructura representada en la Figura 1 (g)(ii), en la que los dominios variables sencillos V_H y V_L forman cada uno un sitio de unión a antígeno o epítope respectivo y la especificidad por antígeno o epítope de los dominios variables sencillos es diferente.