Anticuerpos de dominio único contra TNFR1 y procedimientos de uso de los mismos.

Un antagonista del factor de necrosis tumoral (TNFR1) que se une al TNFR1 e inhibe la transducción de señal a través de TNFR1;

(i) en el que dicho antagonista no innhibe la unión de TNFα to TNFR1;

(ii) en el que dicho antagonista es un anticuepro de dominio (dAb); y

(iii) en el que dicho dAb comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% homóloga a la secuencia de aminoácidos de TAR2h-205 (SEC ID N º 627 en la Figura 271).

Anticuerpos de dominio ïnico contra TNFR1 y procedimientos de uso de los mismos Solicitudes relacionadas La presente solicitud es una continuaciïn en parte de la solicitud de patente de EE.UU. Nï 10/985.847, presentada el 10 de noviembre de 2004, que es 1) una continuaciïn en parte de la solicitud internacional nï PCT/GB2004/004253, designada por EE.UU. y

presentada el 8 de octubre de 2004; y

2) una continuaciïn en parte de la solicitud internacional nï PCT/GB2003/005646, designada por EE.UU. y

presentada el 24 de diciembre de 2003, y reivindica prioridad sobre la solicitud del Reino Unido Nï GB

0230202, 4, presentada el 27 de diciembre de 2002 y la solicitud del Reino Unido Nï GB 0327706, 8 presentada el

de noviembre de 2003, que es una continuaciïn en parte de la solicitud internacional nï PCT/GB2003/002804, designada por EE.UU. y

presentada el 30 de junio de 2003 y reivindica prioridad sobre la solicitud del Reino Unido Nï GB 0230202, 4,

presentada el 27 de diciembre de 2002, que es una continuaciïn en parte de la solicitud internacional nï PCT/GB02/03014, designada por EE.UU. y

presentada el 28 de junio de 2002.

Antecedentes de la invenciïn El dominio de uniïn a antïgeno de un anticuerpo comprende dos regiones separadas: un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL: que pueden ser Vκ o Vλ) . El propio sitio de uniïn a antïgeno estï formado por seis bucles polipeptïdicos: tres procedentes del dominio VH (H1, H2 y H3) y tres procedentes del dominio VL (L1, L2 y L3) . Un diverso repertorio principal de genes V que codifican los dominios VH y VL se produce mediante la reordenaciïn combinatoria de los segmentos gïnicos. El gen de VH se produce mediante la recombinaicïn de tres segmentos gïnicos, VH, D y JH. En seres humanos, existen aproximadamente 51 segmentos VH funcionales (Cook y Tomlinson (1995) Immunol Today 16: 237) , 25 segmentos D funcionales (Corbett et al. (1997) J. Mol. Biol., 268: 69) , y 6 segmentos JH funcionales (Ravetch et al. (1981) Cell, 27: 583) , dependiendo del haplotipo. El segmento VH codifica la regiïn de la cadena polipeptïdica que forma el primer y el segundo bucles de uniïn a antïgeno del dominio VH (H1 y H2) , en tanto que los segmentos VH, D y JH se combinan para formar el tercer bucle de uniïn a antïgeno del dominio VH (H3) . El gen de VL se produce mediante la recombinaciïn de solo dos segmentos gïnicos, VL y JL. En seres humanos, existen aproximadamente 40 segmentos VK funcionales (Schïble and Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001) , 31 segmentos Vλ funcionales (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res., 7: 250) , 5 segmentos Jκ funcionales (Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem., 257: 1516;4:1990172) y 4 segmentos Jλ funcionales (Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med.,

172: 609) , dependiendo del haplotipo. El segmento VL codifica la regiïn de la cadena polipeptïdica que forma el primer y segundo bucles de fijaciïn del antïgeno del dominio VL (L1 y L2) , en tanto que los segmentos VL y JL se combinan para formar el tercer bucle de fijaciïn del antïgeno del dominio VL (L3) . Se cree que los anticuerpos seleccionados de este repertorio primario son suficientemente diversos para fijar casi todos los antïgenos con una afinidad al menos moderada. Los anticuerpos de alta afinidad se producen por quot;maduraciïn de afinidadquot; de los genes reordenados, donde el sistema inmunolïgico genera y selecciona mutaciones puntuales sobre la base de una union optimizada.

El anïlisis de las estructuras y secuencias de los anticuerpos ha demostrado que cinco de los seis bucles de uniïn a antïgenos (H1, H2, L1, L2, L3) poseen un nïmero limitado de conformaciones de la cadena principal o estructuras canïnicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877) . Las conformaciones de cadena principal estïn determinadas por (i) la longitud del bucle de uniïn del antïgeno, y (ii) residuos particulares,

o tipos de residuos, en ciertas posiciones clave en el bucle de uniïn al antïgeno y el marco del anticuerpo. El anïlisis de las longitudes de los bucles y de los residuos clave ha permitido a los inventores predecir las conformaciones de la cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 codificadas por la mayorïa de las secuencias de los anticuerpos humanos (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220) . Aunque la regiïn H3 es mucho mïs diversa en tïrminos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D) , tambiïn forma un nïmero limitado de conformaciones de la cadena principal para longitudes de bucle cortas, que dependen de la longitud y la presencia de residuos, o tipos de residuo, concretos en posiciones clave en el bucle y la estructura del anticuerpo (Martin y col. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1.

Los anticuerpos biespecïficos que comprenden pares complementarios de las regiones VH yVL se conocen en la tïcnica. Estos anticuerpos biespecïficos deben comprender dos pares de VH y VL, de modo que cada par VH/VL se une a un solo antïgeno o epïtopo. Los procedimientos descritos implican hibridomas hïbridos (Milstein & Cuello AC, Nature 305:537 -40) , minibodies (Hu et al., (1996) Cancer Res 56:3055 -3061;) , diacuerpos (Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444 -6448; WO 94/13804) , anticuerpos recombinantes quelantes (cangrejosCRAbs; (Neri et al., (1995) J. Mol. Biol. 246, 367 -373) , biscFv (por ejemplo, Atwell et al., (1996) Mol. Immunol. 33, 1301 1312) , los anticuerpos estabilizados como “llave en la cerradura” (Carter et al., (1997) Protein Sci. 6, 781 -788) . En cada caso, cada especie de anticuerpo comprende dos sitios de uniïn a antïgeno, cada uno formado por un par complementario de dominios VH y VL. Por tanto, cada anticuerpo es capaz de unirse a dos antïgenos o epïtopos diferentes al mismo tiempo, con la uniïn a cada antïgeno o epïtopo mediada por una VH y su dominio VL complementario. Cada una de estas tïcnicas presenta sus desventajas particulares; por ejemplo, en el caso de los hibridomas hïbridos, los pares VH/VL inactivos pueden reducir en gran medida la fracciïn de IgG biespecïfica. Ademïs, la mayorïa de los enfoques biespecïficos se basan en la asociaciïn de los diferentes pares VH/VL o la asociaciïn de cadenas de pares VH y VL para recrear los dos diferentes sitios de uniïn de VH/ VL. Por lo tanto, es imposible controlar la relaciïn entre los sitios de uniïn a cada antïgeno o epïtopo en la molïcula ensamblada y, por lo tanto, muchas de las molïculas ensambladas se unirïn a un antïgeno o epïtopo pero no al otro. En algunos casos ha sido posible diseïar las cadenas pesadas o ligeras en las interfaces de las subunidades (Carter y col., 1997) con el fin de mejorar el nïmero de molïculas que tienen sitios de uniïn a ambos antïgenos o epïtopos, pero esto nunca da como resultado que todas las molïculas puedan unirse a ambos antïgenos o epïtopos.

Hay algunas pruebas de que dos especificidades de uniïn de anticuerpos diferentes podrïan incorporarse en el mismo sitio de uniïn, pero ïstas representan, generalmente, dos o mïs especificidades que corresponden a antïgenos o epïtopos estructuralmente relacionados o a anticuerpos que son de amplia reactividad cruzada. Por ejemplo, se han descrito anticuerpos de reacciïn cruzada, por lo general en los que dos antïgenos estïn relacionados en la secuencia y la estructura, tales como la lisozima de huevo de gallina y la lisozima de pavo (McCafferty et al., documento WO 92/01047) o al hapteno libre y al hapteno conjugado con el vehïculo (Griffiths AD et al. EMBO J 1994 13:14 3245 -60) . En un ejemplo adicional, en el documento WO 02/02773 (Abbott Laboratories) se describen molïculas de anticuerpo con quot;especificidad doblequot;. Las molïculas de anticuerpo a las que se hace referencia son anticuerpos producidos o seleccionados frente a mïltiples antïgenos, de tal modo que su especificidad se extiende a mïs que un solo antïgeno. Cada par complementario de VH/VL en los anticuerpos del documento WO 02/02773 especifica una sola especificidad de uniïn para dos o mïs antïgenos relacionados estructuralmente; los dominio VH y VL en dichos pares complementarios no poseen ninguno una especificidad diferente. Por tanto, los anticuerpos tienen una amplia especificidad ïnica que abarca dos antïgenos, que estïn estructuralmente relacionados. Ademïs, se han descrito autoanticuerpos naturales que son polirreactivos (Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515 -531, que reaccionan con al... [Seguir leyendo]

1. Un antagonista del factor de necrosis tumoral (TNFR1) que se une al TNFR1 e inhibe la transducciïn de seïal a travïs de TNFR1; (i) en el que dicho antagonista no innhibe la uniïn de TNFα to TNFR1; (ii) en el que dicho antagonista es un anticuepro de dominio (dAb) ; y (iii) en el que dicho dAb comprende una secuencia de aminoïcidos que es al menos un 90% homïloga a la secuencia de aminoïcidos de TAR2h-205 (SEC ID N ï 627 en la Figura 271) .

2. El antagonista de la reivindicaciïn 1, en el que dicho antagonista inhibe la muerte celular inducida por TNF-α en un ensayo de citotoxicidad L929 estïndar de la secreciïn inducida por TNFα de IL-8 en un ensayo estïndar HeLa IL

8.

3. Un ligando que comprende un anticuerpo de dominio (dAb) definido en la reivindicaciïn 1 o la reivindicaciïn 2.

4. El ligando de la reivindicaciïn 3, en el que dicho ligando comprende dichos dAb de uniïn a TNFR1 y un resto de prolongaciïn de la semivida.

5. El ligando de la reivindicaciïn 4, en el que el resto de prolongaciïn de la semivida es un resto polietilenglicol, seroalbïmina o un fragmento de la misma, receptor de transferrina o una porciïn del mismo de uniïn a transferrina,

o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un siito de uniïn para un polipïptido que potencia la semivida in vivo.

6. El ligando de la reivindicaciïn 5, en el que resto de prolongaciïn de la semivida es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un siito de uniïn para seroalbïmina o receptor Fc neonatal.

7. Un ïcido nucleico aislado que codifica un dAb o ligando como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un vector que comprende un ïcido nucleico recombinante que codifica un dAb o ligando como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Una cïlula huïsped que comprende un vector de la reivindicaciïn 8 o un ïcido nucleico de la reivindicaciïn 7.

10. Un procedimiento de producciïn de un polipïptido que comprende mantener una cïlula huïsped de la reivindicaciïn 9 en condiciones adecuadas para la expresiïn del ïcido nucleico recombinante o vector, por medio de lo cual se produce un polipïptido.

11. Una composiciïn farmacïutica, que comprende un dAb de la reivindicaciïn 1 o 2, o ligando de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 y un vehïculo farmacïuticamente aceptable.

12. Uso de un ligando de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 para la fabricaciïn de un medicamento para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad crïnica inflamatoria, un trastorno autoinmune, enfermedad inflamatoria, la artritis, esclerosis mïltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crïnica, neumonïa o shock sïptico.

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