Variantes de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida.

Variantes de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida.

La presente invención se refiere a variantes de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida. La invención también se refiere a una construcción génica, a una célula huésped y a una composición enzimática que comprende dichas variantes. También se proporciona un procedimiento para producir dichas variantes, un procedimiento para producir azúcar fermentable y un procedimiento para producir un bioproducto, tal como bioetanol, a partir de material celulósico con las variantes de beta-glucosidasa, la célula huésped o la composición enzimática que comprende dichas variantes.

La invención pertenece al campo de las enzimas útiles para la producción de bioproductos y, más particularmente, a variantes de la beta-glucosidasa y a su uso en la producción de azúcares fermentables y de etanol a partir de material celulósico.

TÉCNICA ANTERIOR

La biomasa vegetal proporciona una fuente abundante de potencial energía en forma de azúcares y, por tanto, es una importante fuente renovable para la generación de azúcares fermentables. La fermentación de estos azúcares puede dar lugar a productos finales comercialmente valiosos, tales como el etanol también denominado bioetanol.

Aunque la fermentación de los azúcares a etanol es relativamente directa, la conversión eficiente de biomasa celulósica en azúcares fermentables, tales como la glucosa, supone un mayor desafío. La enorme energía potencial de las grandes cantidades de hidratos de carbono que integran la biomasa vegetal no está suficientemente utilizada porque los azúcares forman parte de polímeros complejos (polisacáridos, tales como celulosa y hemicelulosa) y, por tanto, no son fácilmente accesibles para la fermentación. Por tanto, la celulosa se puede tratar previamente, de forma mecánica, química, enzimática o de otros modos, para aumentar su susceptibilidad a la hidrólisis. Después, tras este proceso de pretratamiento tiene lugar una etapa de sacarificación, que es un proceso enzimático por el cual los hidratos de carbono complejos (como almidón o celulosa) se hidrolizan en sus componentes monosacáridos. El objetivo de cualquier tecnología de sacarificación es alterar o eliminar los impedimentos estructurales y de composición para la hidrólisis con el fin de mejorar la tasa de hidrólisis enzimática y aumentar los rendimientos de azúcares fermentables a partir de celulosa o de hemicelulosas (N. Mosier y col., 2005, Bioresource Technology 96, 673-686). Después de esta etapa de sacarificación se realiza un proceso de fermentación.

La hidrólisis enzimática de los polisacáridos en azúcares solubles y, por último, en

monómeros tales como xilosa, glucosa y otras pentosas y hexosas, se cataliza mediante varias enzimas que en conjunto se denominan "celulasas". Las celulasas (1,4-beta-D- glucano-4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.4) son complejos multienzimáticos que comprenden tres componentes principales, endo-p-glucanasa (EC 3.2.1.4), exo-p-glucanasa o celobiohidrolasa (EC 3.2.1.9.1) y p-glucosidasa (EC 3.2.1.21), que se ha demostrado que actúan de forma sinérgica en la hidrólisis de la celulosa (Ekperigin, M.M., 2007, African Journal of Biotechnology, Vol.6 (1), pág. 028-033).

Específicamente, la beta-glucosidasa es una enzima glucosidasa que actúa sobre los enlaces pi->4 que unen dos glucosas o moléculas sustituidas con glucosa (es decir, el disacárido celobiosa). Es una exocelulasa con especificidad por diversos sustratos de beta- D-glucósidos. Cataliza la hidrólisis de residuos terminales no reductores en los beta-D- glucósidos con liberación de glucosa. Por tanto, se usa ampliamente junto con otras celulasas en procesos para la conversión de la biomasa celulósica en azúcares fermentables. Su aplicación en la conversión de biomasa con un contenido elevado en celulosa en azúcares fermentables para la producción de etanol combustible es un área extensamente estudiada.

Por consiguiente, las celulasas microbianas se han convertido en biocatalizadores focales debido a su naturaleza compleja y a sus extensas aplicaciones industriales (Kuhad R. C. y col., 2011, Enzyme Research, Article ID 280696). Hoy en día se ha prestado una considerable atención a los conocimientos actuales sobre la producción de celulasas y los retos en la investigación sobre celulasas, especialmente en la dirección de la mejora de la economía del proceso de varias industrias, con el fin de obtener celulasas con mayor actividad y mejores propiedades. En este sentido, se han diseñado beta-glucosidasas con mejor actividad hidrolítica o termoestabilidad (WO2011063308A2).

Las beta-glucosidasas (BGLs, EC 3.2.1.21) catalizan la transferencia de grupos glicosil entre nucleófilos de oxígeno sobre diferentes tipos de sustratos. Las BGLs con un mecanismo de retención (Rye y col., 2000. Curr. Opin. Chem. Biol. 4), como es el caso de Bgl1, tienen actividad hidrolítica reducida a concentraciones elevadas de sustrato o de producto y esto depende al menos de que se produzcan dos fenómenos diferentes: inhibición y transglicosilación (Bohlin et al., 2013, Appl. Microbiol. Biotechnol., 97(1):159-169). El mecanismo de retención forma inicialmente un complejo glicosil covalente con la enzima.

Este intermedio se descompone en la segunda etapa de la reacción, lo que se puede producir mediante una molécula de agua (actividad hidrolítica) o mediante un azúcar aceptor (actividad de transglicosilación). En la reacción de transglicosilación más sencilla, el aceptor es el propio sustrato. No obstante, la celobiosa se ha descrito como sustrato preferencial para retener a las BGLs en su reacción de transglicosilación.

Una beta glucosidasa con una actividad hidrolítica capaz de producir glucosa de forma eficiente pero con una actividad transglicosiladora reducida sería de utilidad, pudiendo disminuir la síntesis de otros compuestos, tales como etil-beta-D-glucopiranósido en presencia de etanol, de modo que aumentase la producción de azúcares fermentables y mejorara el rendimiento de una mezcla enzimática que contuviera BGL.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe nuevas variantes de beta-glucosidasa con capacidad de transglicosilación reducida para la hidrólisis de material celulósico en azúcares fermentables, así como un procedimiento para producir dichas variantes de beta-glucosidasa, un procedimiento para producir azúcares fermentables y un procedimiento para producir bioproductos, tales como etanol, con dichas variantes.

Por tanto, la presente invención representa una solución a la necesidad de proporcionar variantes de beta-glucosidasa con la propiedad mejorada de una actividad de transglicosilación reducida para la optimización de la etapa de hidrólisis de material celulósico en azúcares fermentables.

La capacidad de transglicosilación de las beta-glucosidasas disminuye la concentración final de azúcares fermentables en etanol y, en consecuencia, el rendimiento del producto final del proceso. Sin embargo, los inventores han demostrado que las variantes de beta-glucosidasa de la presente invención tienen actividad de transglicosilación reducida y, por tanto, aumentan significativamente el rendimiento de la etapa de hidrólisis, lo que conduce a un aumento de la producción del bioproducto, preferiblemente etanol.

La presente invención también proporciona un procedimiento para la selección de variantes de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida. Por tanto, un primer

aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la selección de variantes de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida en comparación con la beta-glucosidasa nativa, en lo sucesivo "primer procedimiento de la invención", que comprende:

a) Incubar las variantes de beta-glucosidasa con p-nitro-fenil-glucopiranósido en presencia de celobiosa,

b) Medir la liberación de p-nitrofenol,

c) Comparar el valor del p-nitrofenol medido en la etapa (b) con un valor de referencia, y

d) Seleccionar aquellas variantes de beta-glucosidasa cuyos valores medidos en la etapa (b) son más elevados que el valor de referencia.

El término "beta-glucosidasa", como se usa aquí, se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de un dímero de azúcar, incluyendo, pero sin limitarnos, celobiosa, con la liberación de un monómero de azúcar correspondiente, la cual se usa, pero sin limitación, para la síntesis de etanol. La enzima beta-glucosidasa actúa sobre los enlaces pi->4 que unen dos glucosas o moléculas sustituidas con glucosa (es decir, el disacárido celobiosa). Es una exocelulasa con especificidad por una variedad de sustratos beta-D-glucósido. Cataliza la hidrólisis de residuos terminales no reductores en los beta-D-glucósidos con liberación de glucosa.

El término "variante", como se usa aquí, se refiere a una enzima que procede de una enzima nativa mediante una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos en los punto(s) dentro de su secuencia de aminoácidos y, por tanto, tiene una secuencia diferente a la de la enzima nativa. Como se usa aquí, la expresión "variante de beta-glucosidasa" significa un polipéptido que tiene actividad beta-glucosidasa producido por un organismo que expresa una secuencia de nucleótidos modificada que codifica... [Seguir leyendo]

1. Una variante de beta-glucosidasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con la SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácido en la posición Q211 correspondiente a las posiciones 1 a 871 de la SEQ ID NO: 2, donde la variante de beta-glucosidasa tiene una actividad de transglicosilación reducida en comparación con la beta-glucosidasa nativa.

2. La variante de beta-glucosidasa de acuerdo con la reivindicación 1, donde la sustitución del aminoácido es Q211H.

3. La variante de beta-glucosidasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4.

4. La variante de beta-glucosidasa de acuerdo con la reivindicación 3, que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4.

5. La variante de beta-glucosidasa de acuerdo con la reivindicación 3, que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5.

6. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la variante de beta-glucosidasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una secuencia de ácido nucleico aislada complementaria a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una construcción génica que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7.

9. La construcción génica de la reivindicación 8, donde la construcción génica es un vector de expresión.

10. Una célula huésped que comprende la construcción génica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9.

11. La célula huésped de la reivindicación 10, donde dicha célula es Myceliophthora thermophila C1.

12. Una composición enzimática que comprende la variante de beta-glucosidasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

13. La composición enzimática de la reivindicación 12, que además comprende otras enzimas celulolíticas.

14. La composición enzimática de acuerdo con la reivindicación 13, donde las otras enzimas celulolíticas se seleccionan de la lista que consiste en: endoglucanasas, beta- glucosidasas, celobiohidrolasas, beta-xilosidasas o cualquier combinación de las mismas.

15. La composición enzimática de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 que además comprende la célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11.

16. Un procedimiento para la selección de la variante de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida en comparación con la beta-glucosidasa nativa, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende:

a. Incubar variantes de beta-glucosidasa que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con la SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácido en la posición Q211 correspondiente a las posiciones 1 a 871 de la SEQ ID NO: 2, con p-nitro-fenil-glucopiranósido en presencia de celobiosa,

b. Medir la liberación de p-nitrofenol,

c. Comparar el valor del p-nitrofenol medido en la etapa (b) con un valor de referencia, y

d. Seleccionar aquellas variantes de beta-glucosidasa cuyos valores medidos en la etapa (b) son más elevados que el valor de referencia.

17. Un procedimiento para producir la variante de beta-glucosidasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende el diseño de una librería de mutantes de enzimas beta-glucosidasa que presentan una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con la SEQ ID NO: 2 y comprenden una sustitución de

aminoácido en la posición Q211 correspondiente a las posiciones 1 a 871 de la SEQ ID NO: 2, y la selección de la variante de beta-glucosidasa con actividad de transglicosilación reducida, de acuerdo con las etapas (a) a (d) del procedimiento de la reivindicación 16.

18. Un procedimiento para producir azúcar fermentable, que comprende:

a. Incubar material celulósico con la variante de beta-glucosidasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con la célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 o con la composición enzimática de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 y

b. Recuperar el azúcar fermentable obtenido tras la incubación en la etapa (a).

19. Un procedimiento para producir un bioproducto que comprende:

a. Incubar material celulósico con la variante de beta-glucosidasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con la célula huésped de acuerdo con cualquiera de

las reivindicaciones 10 u 11o con la composición enzimática de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15,

b. Fermentar los azúcares fermentables obtenidos tras la incubación de la etapa (a) con al menos un microorganismo fermentador, y

c. Recuperar el bioproducto obtenido tras la fermentación en la etapa (b).

20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, donde el bioproducto es etanol.