SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS Y DE AMINOÁCIDOS DE PHOTOBACTERIUM DAMSELAE NOVEDOSA Y SUS USOS.

Una secuencia de aminoácido aislada a partir de Photobacterium damselae subsp. Piscicida, que comprende la SEQ ID NO:2

Campo de la invención

La invención se relaciona con una novedosa proteína secretada a partir del Photobacterium damselae subsp. piscicida, y con el uso de la proteína o una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína en una vacuna contra la pasteurelosis en peces.

Antecedentes de la Invención

La mortalidad resultante a partir de infecciones con Photobacterium damselae subsp, piscicida (antiguamente Pastourelle piscicida) causa las pérdidas más significantes en acuicultura marina de agua caliente en todo el mundo. La enfermedad (pasteurelosis) tiene gran impacto económico en Japón, donde afecta principalmente a los cultivos de medregal del Japón, y en la zona del mediterráneo, debido a las pérdidas que causan en cultivos del besugo y de la lubina. La terapia con antibióticos por lo general no es efectiva e indeseable debido a su impacto ambiental negativo. El desarrollo de una vacuna contra esta enfermedad ha sido lento, predominantemente como resultado del patógeno que es facultativamente intracelular, y por consiguiente no se expone generalmente a mecanismos de defensa inmunes. Hasta ahora, la investigación de vacunas se ha centrado en bacterinas preparadas a partir de células muertas por formalina o calor. Una vacuna de bacterina enriquecida en productos extracelulares (ECPs) llamada "DI21" ha sido comercializada en algunos países Europeos. El grado de eficacia obtenida con estas bacterinas es muy variable y la duración de la protección, con frecuencia es corta.

Existe una necesidad no satisfecha en el campo para administrar una vacuna efectiva no costosa, fácil de fabricar, y reproducible contra Infección por Photobacterium.

Resumen de la Infección

En un primer aspecto, la invención proporciona una proteína extracelular 55kDa aislada o purificada a partir de Photobacterium damselae subsp. piscicida, y los anticuerpos construidos de esta.

En un segundo aspecto la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de 55kDa

También se proporcionan un vector de expresión de ADN portador de la secuencia de ácido nucleico de p55, y una célula huésped transformada con el vector de expresión de ADN.

En un tercer aspecto, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende una proteína extracelular de 55kDa aislada o purificada a partir del Photobacterium damselae subsp. piscicida, y un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una proteína extracelular de 55kDa aislada o purificada a partir del Photobacterium damselae subsp. piscicida, como un medicamento.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una proteína extracelular de 55kDa aislada o purificada a partir del Photobacterium damselae subsp. piscicida, en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de la pasteurelosis en peces.

Descripción de las Figuras

Figura 1 (SEQ ID NO:1) muestra la secuencia de ADN de la proteína de p55 identificada en MT1415 (una cepa virulenta de Ph. damselae subsp. piscicida).

Figura 2 (SEQ ID NO:2) muestra la secuencia de aminoácido deducida de p55; la secuencia señal de aminoácido 16, que puede ser transformada para formar la proteína madura está sombreada.

Descripción Detallada de la Invención

La proteína que constituye el objeto de la presente invención fue purificada a partir de una preparación de productos extracelulares (ECP) a partir del Photobacterium damselae susp. piscicida virulento. Por SDS-PAGE esta proteína purificada fue juzgada para correr junto con un marcador de 55kDa. Para mayor comodidad, esta proteína se conoce como la proteína de 55kDa o p55. Se ha descubierto que esta proteína juega un papel importante en la inducción de la apoptosis en fagocitos peritoneales durante la infección. La proteína de 55kDa se ha clonado y secuenciada; la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácido deducida se describen en la Figuras 1 y 2, respectivamente. El gen p55 o secuencia del ácido nucleico "aislada" se entiende que significa el gen o la secuencia diferente de su contexto natural en el genoma de Ph. damselae.

La proteína de 55kDa de la presente invención es distinta del así llamado complejo de proteína ECP 55kDa a partir del Photobacterium revelado en WO 01/10459, que en realidad está cercana a 52kDa en tamaño. Se demostró que este complejo ECP 55kDa consiste de al menos dos diferentes entidades, ninguno de los cuales tiene una secuencia N-terminal relacionada con la secuencia de p55 revelada en este documento. El complejo ECP 55kDa de WO 01/10459 se expresa en condiciones de cultivo suplementado con hierro, mientras que la proteína de 55kDa de la presente invención es la principal proteína secretada en la fase exponencial media independiente del nivel de hierro en el medio de cultivo. Adicionalmente, cuando el antisuero construido contra el complejo ECP 55kDa de WO 01/10459 fue utilizado para tratar preparaciones de ECP para retirar esta proteína, las propiedades apoptogénicas de la preparación de ECP tratada no fueron afectadas.

Hemos querido evaluar si la inmunización de los peces con p55 nativo purificado podría provocar una respuesta inmune protectora contra la infección por Photobacterium. Sin embargo, se encontró que la proteína era altamente tóxica para los peces cuando se administra en la forma purificada nativa, lo que lleva a una muerte rápida. En su lugar, utilizamos un método de administración pasiva para demostrar que los anticuerpos construidos contra esta proteína de 55kDa en conejos (que específicamente une al p55 secretado por las células de Photobacterium virulentas In vivo), son capaces de reducir las mortalidades relacionadas con el Photobacterium a un grado significante (Ejemplo 3).

Los beneficios de la inmunización pasiva pueden ser superados por la inmunización activa, por lo cual los anticuerpos se construyen para la proteína de 55kDa por los propios peces, después de la vacunación con un derivado de la proteína que es menos tóxico que la forma nativa, según se demuestra en el Ejemplo 4.

En la preparación de productos extracelulares a partir de Ph. damselae subsp. piscicida, Hemos descubierto que p55 es la principal proteína secretada en cultivos bacterianos cultivados a una fase exponencial media, que constituye más del 85% de la proteína secretada bajo estas condiciones (sobrenadantes bacterianos más viejos exponencial final para la fase estacionaria – tienen un patrón de proteína mucho más complejo, aunque p55 también está presente), la invención en un aspecto se relaciona en general con las preparaciones de ECP inactivadas enriquecidas en p55 para utilizar en las vacunas. Preferiblemente estas preparaciones de ECP se preparan bajo condiciones de hierro normales, i.e. las células se cultivan en medio de cultivo que no es suplementado con hierro, ni incorporando agentes quelantes de hierro. La concentración de hierro del medio es preferiblemente <15µM, más preferiblemente <10 µM, más preferiblemente <1µM, y más preferiblemente <0.1µM. Una modalidad preferida de la invención se relaciona con una vacuna que comprende un sobrenadante del cultivo concentrado a partir del Ph. damselao subsp. piscicida, preferiblemente cultivado a fase exponencial media, que ha sido inactivado. La "fase exponencial media" se refiere a una densidad óptica (OD) a 600nm de 0.5-0.7, preferiblemente 0.55-0.65, más preferiblemente aproximadamente 0.6. El sobrenadante preferiblemente se separa fuera de las células antes de la etapa de inactivación. El sobrenadante del cultivo celular opcionalmente se concentra para utilizar (antes de o después de la inactivación), por ejemplo 1.5 - 200 veces, opcionalmente 5-150 veces, por ejemplo 50-100 veces. Los métodos convencionales para la concentración del sobrenadante pueden ser empleados, incluyendo dispositivos de filtración centrífuga, la ultracentrifugación, diálisis vacío, precipitación con sulfato de amonio, y similares. El Ejemplo 1 indica un modo de preparar un sobrenadante de cultivo concentrado, y el Ejemplo 4 enseña una etapa de inactivación con formaldehído. Ejemplos apropiados de agentes de inactivación incluyen formaldehído, saponinas, beta-propiolactona (BPL), y etilenoimina binaria (BEI). Una proteína "aislada" o "purificada" se define por ser sustancialmente libre de material libre u otras proteínas contaminantes a partir de la célula o fuente... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia de aminoácido aislada a partir de Photobacterium damselae subsp. Piscicida, que comprende la SEQ ID NO: 2.

2. Una secuencia de aminoácido aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia comprende la SEQ ID No.2, sin la secuencia señal de aminoácidos 1 a 16, MTAIFSLAINSNFVLA.

3. Una secuencia de ácido nucleico aislada a partir de Photobacterium damselae subsp. Piscicida, que comprende la SEQ ID NO: 1.

4. Una vacuna que comprende una secuencia de aminoácido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y un portador farmacéuticamente aceptable.

5. Secuencia de aminoácido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para utilizar como un medicamento.

6. Uso de una secuencia de aminoácido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar la pasteurelosis en peces.

7. Los anticuerpos construidos contra una secuencia de aminoácido aislada de la reivindicación 1 o la reivindicación

2.

8. Un vector de expresión de ADN, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 3, en donde dicha secuencia de ácido nucleico se liga operativamente a una secuencia reguladora transcripcional.

9. Una célula huésped transformada con el vector de expresión de ADN de la reivindicación 8.

10. Una vacuna que comprende el vector de expresión de ADN de la reivindicación 8, y un portador farmacéuticamente aceptable.

11. Uso de una secuencia de aminoácido aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2; o una secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 3; o los anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 7, en la fabricación de una prueba para el diagnóstico de la infección con Photobacterium damselae subsp. piscicida o de la pasteurelosis en peces.

12. Un kit de prueba de diagnóstico que comprende una secuencia de aminoácido aislada de acuerdo con la reivindicación 1; o una secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 3; o los anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 7, fijados a una matriz.