Proteínas intramoleculares covalentemente reticuladas, utilizadas como socios de unión en los inmunoensayos.

Empleo de las proteínas de virus covalentemente intramolecularmente reticuladas,

mediante una modificaciónquímica, como antígenos en la detección de un anticuerpo dirigido contra este antígeno en un procedimientode ensayo inmunológico en un formato de ensayo 5 heterogéneo, en el cual después de efectuada la reaccióninmunológica, tiene lugar la separación de la fase sólida de la fase líquida, caracterizado porque, comoantígeno, se emplea la transcriptasa de HIV inversa.

Proteínas intramoleculares covalentemente reticuladas, utilizadas como socios de unión en los inmunoensayos

La presente invención se refiere al empleo de la transcriptasa inversa del virus HIV covalentemente reticulada, como socio de unión inmunológica en los inmunoensayos, a procedimientos de ensayo inmunológico para la detección de un analito en una muestra, en los que se emplea como socio de unión la transcriptasa de HIV inversa intramolecular covalentemente reticulada, a la transcriptasa de HIV inversa intramolecular covalentemente reticulada, así como a un procedimiento para la obtención de esta transcriptasa inversa.

El empleo de proteínas como socios de unión para la detección de analitos en procedimientos de ensayo para inmunodiagnóstico, es ya conocido desde hace tiempo. En todos los inmunoensayos habituales, la muestra se incuba con uno o varios socios de unión específica para los analitos. El socio o los socios de unión se unen específicamente a los analitos que hay que detectar. En el caso de la detección de un anticuerpo -por ejemplo, en el caso de una infección por HCV- la muestra que se va a investigar se pone en contacto por ejemplo con un antígeno HCV, el cual se une específicamente al anticuerpo anti-HCV que se quiere detectar. En una detección de antígeno como por ejemplo en la detección del marcador tumoral del antígeno específico de la próstata (PSA) la muestra se pone en contacto con los anticuerpos los cuales se unen específicamente al PSA en la muestra.

A continuación tiene lugar en todos los inmunoensayos la detección del analito. Esto puede lograrse por ejemplo mediante la unión y seguidamente la detección de otro socio de unión provisto de un marcador detectable, el cual se forma en el complejo que forman el analito y el socio de unión inmunológica.

En general los inmunoensayos se efectúan en un formato de ensayo heterogéneo u homogéneo. Los formatos de ensayo heterogéneos se efectúan a menudo como un ensayo sándwich o un ensayo puente. También se conocen procedimientos competitivos en los cuales o bien el analito o bien el socio de unión específico del complejo formado por el analito y el socio de unión específico, son desplazados por ejemplo mediante la adición de un análogo marcado del analito.

Es importante que en todos los procedimientos de ensayo inmunológico, los reactantes empleados como socios de unión inmunológica específica estén en forma estable y que éstos por ejemplo, debido a sus inadecuadas condiciones de almacenamiento no sean destruidos. Este peligro existe en particular cuando las proteínas empleadas como socios de unión específicos están compuestas de varias subunidades. Las subunidades pueden mantenerse unidas covalentemente como por ejemplo mediante puentes de disulfuro, o no covalentemente, por ejemplo mediante puentes de hidrógeno, cargas opuestas y/o interacciones hidrófobas.

En algunos casos tienen lugar inestabilidades y desnaturalizaciónes en las condiciones de almacenamiento de las materias primas necesarias para el ensayo inmunológico (por ejemplo, en el reactivo líquido) , en las soluciones de trabajo preparadas para el ensayo o en los alrededores de la propia reacción inmunológica, . Estas conducen a que tanto la estructura terciaria como la estructura cuaternaria de las proteínas, cambien, de manera que la materia prima ya no puede emplearse en el inmunoensayo.

Entre las condiciones desfavorables está la separación de las subunidades inherentes a las proteínas empleadas como socios de unión específicos. Esta disociación de sus unidades puede ser causada en el caso de puenteados covalentes de manera natural, por ejemplo, por reducción de los puentes de disulfuro mediante los aditivos tampón habituales como el DTT.

Todavía es mayor de todas formas el peligro de disociación de las subunidades unidas covalentemente de una proteína, que se mantienen juntas mediante las cargas o las interacciones hidrófobas. En estas proteínas puede desencadenarse la disociación de las subunidades muy fácilmente mediante adiciones corrientes de tampón, como sales o detergentes, o por desfavorables fluctuaciones del pH y de la temperatura. Una subunidad individual, casi sin apoyo, está por ello también expuesta a la desnaturalización. A consecuencia de ello, la estructura terciaria de la proteína o respectivamente de la subunidad individual, puede cambiar de forma importante. Esto significa que también las propiedades inmunológicas, como por ejemplo la acción de accesabilidad de importantes epítopos, cambia tan radicalmente, que la proteína empleada en el inmunoensayo como socio de unión, ya no reconoce más inmunológicamente, lo cual significa que ya no se une específicamente.

Otro peligro de la disociación de las subunidades consiste en que debido al ajuste del equilibrio químico las subunidades provistas de diferentes grupos de marcado se reasocien de nuevo. Si en el caso concreto de una proteína compuesta de dos subunidades para emplear en una detección de anticuerpos en el formato de ensayo puente por un lado se derivatiza para emplear en una fase sólida universal, y por otro lado la misma proteína es empleada también como componente dador de una señal, y para esta finalidad se copula con un marcador (por ejemplo una enzima, un marcador de fluorescencia o quimioluminiscencia) , puede suceder lo siguiente: que la curva de calibración, producida al principio con muestras positivas (muestras que contienen el analito) , se vuelva cada vez más plana durante el transcurso del tiempo. Las señales de las pruebas negativas (valores en blanco) , crecen y se aproximan a los valores de las pruebas positivas anteriores cada vez más, de manera que ya no es posible reconocer ninguna diferenciación entre las muestras sin analito y las muestras que contienen analito.

En la solicitud de patente alemana DE 26 15 349 se describe un procedimiento para la modificación química de las enzimas mediante la reacción con quinonas. Estas modificaciones producen un aumento de estabilidad, lo cual tiene como consecuencia una mejor actividad enzimática. De esto se deduce que la reticulación de las moléculas de enzima tiene lugar entre sí, es decir intermolecularmente, pero también intramolecularmente. La obtención de epítopos inmunoreactivos no juega aquí ningún papel. El empleo de enzimas modificadas con quinonas en los procedimientos inmunodiagnósticos, no se describe.

Debyser y De Clercq (Protein Science ("Ciencia de las Proteínas") 1996, 5, pags. 278-286) describen la reticulación de las dos subunidades de la transcriptasa inversa (RT) de HIV-1 mediante el suberimidato de dimetilo, con lo cual las cadenas laterales de lisina, están unidas entre sí. La finalidad de la reticulación es la investigación de la dimerización de las dos subunidades RT. Solamente los dímeros den RT son enzimáticamente activos. La reticulación covalente de las dos subunidades tiene lugar por el contrario en diferentes inhibidores. Según la efectividad del inhibidor se originan después de la reacción química de reticulación más o menos fuertes moléculas de RT reticuladas o respectivamente multímeros. El efecto de la reticulación sobre los epítopos inmunológicamente relevantes, o el empleo de moléculas reticuladas en el inmunoensayo no juegan ningún papel.

En la patente EP-A-0 331 068 se da a conocer el empleo de inmunoglobulinas reticuladas intermolecularmente en ensayos inmunológicos. Es decir, varias moléculas de inmunoglobulina o respectivamente sus fragmentos se unen covalentemente entre sí. Los multímeros de los anticuerpos o respectivamente sus fragmentos, se emplean como reactivo de supresión. Las inmunoglobulinas reticuladas o respectivamente sus segmentos deben eliminar los factores que estorban dirigidos a las inmunoglobulinas en los sueros humanos.

Las proteínas reticuladas descritas en el estado actual de la técnica, las cuales en condiciones naturales constan de varias subunidades, no son adecuadas para el empleo como antígenos o respectivamente como socios de unión inmunológicos o sólo son adecuadas con condiciones, puesto que en general los multímeros intermoleculares constan de varias moléculas de proteína. Estos multímeros son adecuados solamente en ciertas condiciones en los ensayos inmunológicos, puesto que su tamaño, la mayor parte de las veces, no está definido exactamente. Los multímeros existen con ello solamente en una distribución estadística de tamaños, es decir existen mono, di, tri, tetrámeros, uno junto a otro en un conjunto. Mediante la reticulación indefinida... [Seguir leyendo]

1. Empleo de las proteínas de virus covalentemente intramolecularmente reticuladas, mediante una modificación química, como antígenos en la detección de un anticuerpo dirigido contra este antígeno en un procedimiento de ensayo inmunológico en un formato de ensayo heterogéneo, en el cual después de efectuada la reacción inmunológica, tiene lugar la separación de la fase sólida de la fase líquida, caracterizado porque, como antígeno, se emplea la transcriptasa de HIV inversa.

2. Procedimiento de ensayo inmunológico para la detección de un analito en una muestra, caracterizado porque, como socio de unión inmunológica se emplea un antígeno covalentemente intramolecularmente reticulado según la reivindicación 1.

3. Método de ensayo inmunológico de acuerdo con lo reivindicación 2, caracterizado porque, es un método para el diagnóstico de infecciones de HIV.

4. Transcriptasa inversa covalentemente intramolecularmente reticulada (RT) de HIV, en la cual exclusivamente las dos subunidades de RT están covalentemente reticuladas entre sí y no está presente ninguna ligazón intermolecular entre distintas moléculas de RT, caracterizada porque, como reactivo de reticulación se emplea el MHS (3-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimidéster) , el EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) , el DSS (suberato de disuccinimidilo) , el HSAB (N-hidroxi-succinimidil-4-azidobenzoato) , ó el sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidil-6 (4'-amido-2'-nitrofenilamido) hexanoato) .

5. Procedimiento para la obtención de la transcriptasa inversa intramolecularmente reticulada HIV según la reivindicación 4, el cual comprende los siguientes pasos:

(a) preparación de la RT en forma disuelta

(b) reacción de la RT con un reactivo de bloqueo para los grupos –SH

(c) diálisis de la mezcla frente a un tampón acuoso

(d) reacción de la RT activada con el reactivo de reticulación MHS (3-maleimidobenzoil-Nhidroxisuccinimidéster) , el EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimid) , el DSS (suberato de disuccinimidilo) , el HSAB (N-hidroxi-succinimidil-4-azidobenzoato) ) , ó el sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidil-6 (4'-amido-2'-nitrofenilamido) hexanoato) , en donde se escoge una estequiometría de la RT respecto al reactivo de reticulación, de 1:1 hasta 1:20

(e) eventualmente, interrupción de la reacción

(f) separación de los reactantes en exceso del producto de reacción mediante diálisis

(g) eventualmente, exposición del producto de reacción dializado, con luz UV.