Procedimientos de utilización de polinucleótidos artificiales y sus composiciones para reducir el silenciamiento de transgenes.

Una célula vegetal, una planta o su progenie tolerantes al glifosato,

que comprende al menos dospolinucleótidos, en la que dichos al menos dos polinucleótidos codifican polipéptidos de EPSPS que son al menos98% idénticos, siendo al menos uno de dichos al menos dos polinucleótidos un transgén que comprende SEQ IDNO:3, SEQ ID NO:4, 5 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18 o SEQ IDNO:35, y dichos al menos dos polinucleótidos son sustancialmente divergentes y son menos del 85% similares ensus secuencias polinucleotídicas.

Procedimientos de utilización de polinucleótidos artificiales y sus composiciones para reducir el silenciamiento de transgenes Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere a la ingeniería genética de plantas. Más en concreto, la invención también se refiere a células vegetales, plantas o su progenie tolerantes al glifosato, que contienen polinucleótidos artificiales específicos que codifican un polipéptido de EPSPS.

Descripción de la técnica relacionada Pueden aislarse genes heterólogos a partir de una fuente diferente de la planta en la que se van a transformar, o pueden modificarse o diseñarse para que tengan cualidades diferentes o mejoradas. Los rasgos o cualidades de interés particularmente deseables para la ingeniería genética de plantas incluyen, pero no se limitan a la resistencia a insectos, a enfermedades fúngicas, y otras plagas y agentes causantes de enfermedad, la tolerancia a herbicidas, una estabilidad o caducidad potenciada, rendimiento, tolerancias a estreses ambientales, y potenciaciones nutricionales.

Los procedimientos de biología molecular tradicionales para generar nuevos genes y proteínas en general implican la mutagénesis aleatoria o dirigida. Un ejemplo de mutagénesis aleatoria es una técnica recombinante conocida como "reordenamiento del ADN", según se describe en las patentes de EEUU 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.837.458, y los documentos WO 98/31837, WO 99/65927. Un procedimiento alternativo para la evolución molecular implica un procedimiento de extensión en etapas (StEP) para la mutagénesis y recombinación in vitro de secuencias de moléculas de ácidos nucleicos, según se describe en la patente de EEUU 5.965.408. Un ejemplo de mutagénesis dirigida es la introducción de una mutación puntual en un sitio específico en un polipéptido. Una estratega alternativa, que es útil cuando el gen heterólogo procede de una fuente no vegetal, es diseñar un gen insecticida artificial que usa el codón que se emplea de modo más habitual en la tabla de utilización de codones de la planta del maíz (Koziel et al., 1993, Biotechnology, 11, 194-200) . Fischhoff y Perlak (patente de EEUU n.º 5.500.365) divulgan una mayor expresión de la proteína insecticida de Bacillus thuringiensis (Bt) comparada con plantas cultivadas, cuando la secuencia del polinucleótido se modifica para reducir la aparición de secuencias desestabilizantes. Es necesario modificar la secuencia del polinucleótido de Bt de tipo salvaje, porque el polinucleótido de Bt de longitud completa de tipo salvaje no expresa niveles suficientes de proteína insecticida en plantas para que sea útil desde un punto de vista agronómico.

Los genes heterólogos se clonan en vectores adecuados para la transformación de plantas. Las técnicas de transformación y regeneración útiles para incorporar genes heterólogos en el genoma de una planta son muy conocidas en la técnica. El gen después puede expresarse en la célula vegetal para que muestre la característica o el rasgo añadido. Sin embargo, los genes heterólogos que normalmente se expresan bien como transgenes pueden sufrir el silenciamiento de genes cuando más de una copia del mismo gen se expresa en la misma planta. Esto puede suceder cuando un primer gen heterólogo es demasiado similar a una secuencia de ADN de un gen endógeno en la planta. Otros ejemplos incluyen cuando una planta transgénica posteriormente se cruza con otras plantas transgénicas que tienen el mismo transgén o transgenes similares, o cuando la planta transgénica se vuelve a transformar con un módulo de expresión de plantas que contiene el mismo gen o un gen similar. De forma parecida, puede producirse el silenciamiento de genes si el apilamiento de rasgos emplea los mismos elementos genéticos utilizados para dirigir la expresión del gen transgénico de interés. Para apilar rasgos, las líneas transgénicas estables deben prepararse con diferentes combinaciones de genes y elementos genéticos para evitar el silenciamiento de genes. La N-fosfonometilglicina, también conocida como glifosato, es un herbicida muy conocido que tiene actividad en un amplio espectro de especies vegetales. El glifosato es el ingrediente activo de Roundup! (Monsanto Co.) , un herbicida seguro que tienen una semivida deseablemente corta en el entorno. Cuando se aplica a una superficie vegetal, el glifosato se mueve de modo sistémico a través de la planta. El glifosato es fitotóxico debido a que inhibe la vía del ácido shikímico, que proporciona un precursor para la síntesis de aminoácidos aromáticos. El glifosato inhibe la enzima 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimato sintasa (EPSPS) .

También puede lograrse la tolerancia al glifosato mediante la expresión de variantes de EPSPS que tienen menor afinidad por el glifosato y, así, mantener su actividad catalítica en presencia del glifosato (patente de EEUU n.º 5.633.435) . Las enzimas que degradan el glifosato en tejidos vegetales (patente de EEUU n.º 5.463.175) también son capaces de conferir tolerancia celular al glifosato. Estos genes se emplean para la producción de cultivos transgénicos que son tolerantes al glifosato, permitiendo con ello utilizar el glifosato para el control eficaz de especies adventicias con problemas mínimos de daños para el cultivo. Por ejemplo, la tolerancia al glifosato se ha introducido genéticamente en el maíz (patente de EEUU n.º 5.554.798) , trigo (solicitud de patente de EEUU n.º

20020062503) , soja (solicitud de patente de EEUU n.º 20020157139) y canola (documento WO 9204449) . Los transgenes para la tolerancia al glifosato y los transgenes para la tolerancia a otros herbicidas, por ejemplo, el gen bar (Toki et al., Plant Physiol., 100:1503-1507, 1992; Thompson et al., EMBO J., 6:2519-2523, 1987, fosfinotricina acetiltransferasa, gen BAR aislado de Streptomyces; DeBlock et al., EMBO J., 6:2513-2522, 1987, herbicida glufosinato) también son útiles como marcadores seleccionables o marcadores puntuables, y pueden proporcionar un fenotipo útil para la selección de plantas unido a otros rasgos útiles desde el punto de vista agronómico.

En la técnica son necesarios procedimientos para diseñar genes para la expresión en plantas para mejorar rasgos útiles desde el punto de vista agronómico que eviten el silenciamiento de genes cuando se insertan múltiples copias y se produce la recombinación con genes vegetales endógenos.

Breve descripción de los dibujos Figura 1. Comparación en apilamiento de los cambios en las secuencias polinucleotídicas de dos versiones de EPSPS de arroz artificiales (OsEPSPS_AT, OsEPSPS_ZM) y una EPSPS de arroz nativa (OsEPSPS_Nat) , cuyos polipéptidos están modificados para ser resistentes al glifosato.

Figura 2. Comparación en apilamiento de las secuencias polinucleotídicas de una EPSPS de maíz nativa (ZmEPSPS_Nat) y artificial (ZmEPSPS_ZM) , cuyos polipéptidos están modificados para ser resistentes al glifosato.

Figura 3. Comparación en apilamiento de las secuencias polinucleotídicas de una EPSPS de soja nativa (GmEPSPS_Nat) y una versión artificial (GmEPSPS_GM) , cuyos polipéptidos están modificados para ser resistentes al glifosato.

Figura 4. Comparación en apilamiento de las secuencias polinucleotídicas de un gen BAR nativo (BAR1_Nat) y dos versiones artificiales con sesgo de codones de Zea mays (BAR1_ZM) y Arabidopsis thaliana (BAR1_AT) .

Figura 5. Comparación en apilamiento de las secuencias polinucleotídicas de CTP2 y CP4EPSPS nativas (CTP2CP4_Nat) y versiones artificiales (CTP2CP4_AT, CTP2CP4_ZM, y CTP2CP4_GM) .

Figures 6 a 25. Mapas de plásmidos de pMON54949, pMON54950, pMON30151, pMON59302, pMON59307,

pMON42411, pMON58400, pMON58401, pMON54964, pMON25455, pMON30152, pMON54992, pMON54985, pMON20999, pMON45313, pMON59308, pMON59309, pMON59313, pMON59396 y pMON25496, respectivamente.

Breve descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO:1 OsEPSPS_TIPS Una secuencia de una proteína de EPSPS de arroz modificada para que sea resistente al glifosato, con el péptido de tránsito del cloroplasto.

SEQ ID NO:2 OsEPSPS_Nat Una secuencia polinucleotídica de un polinucleótido de EPSPS nativo de arroz modificado para que sea codifique una proteína resistente al glifosato.

SEQ ID NO:3 OsEPSPS_AT Una secuencia polinucleotídica de un polinucleótido de EPSPS de arroz artificial utilizando la tabla de utilización de codones de Arabidopsis, y posteriormente modificada para que codifique una proteína resistente al glifosato.

SEQ ID NO:4 OsEPSPS_ZM Una secuencia polinucleotídica de un polinucleótido de EPSPS de arroz artificial utilizando la tabla de utilización de codones de Zea mays, y posteriormente modificada para que codifique una proteína resistente... [Seguir leyendo]

1. Una célula vegetal, una planta o su progenie tolerantes al glifosato, que comprende al menos dos polinucleótidos, en la que dichos al menos dos polinucleótidos codifican polipéptidos de EPSPS que son al menos 98% idénticos, siendo al menos uno de dichos al menos dos polinucleótidos un transgén que comprende SEQ ID

NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO:35, y dichos al menos dos polinucleótidos son sustancialmente divergentes y son menos del 85% similares en sus secuencias polinucleotídicas.

2. La célula vegetal, la planta o su progenie de la reivindicación 1, que se selecciona del trigo, maíz, arroz, soja, algodón, patata, canola, césped, árboles forestales, grano de sorgo, cultivos vegetales, plantas ornamentales,

cultivos de forraje y cultivos frutales.

3. Un procedimiento de selección de células vegetales, plantas o su progenie tolerantes al glifosato de la reivindicación 1 o 2, que comprende las etapas de:

(a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende: una molécula de promotor que opera en plantas, unida operablemente a una molécula polinucleotídica artificial seleccionada de SEQ ID NO:3, 15 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO:35; y

(b) cultivar dicha célula vegetal en un medio selectivo que contiene glifosato para destruir selectivamente las células que no han sido transformadas con dicha construcción de ADN; y

(c) regenerar dicha célula vegetal en una planta fértil.