Péptidos.

Un ensayo de detección selectiva para determinar la interacción entre un oligopéptido cíclico y un ligando diana,

donde el oligopéptido cíclico es un oligopéptido cíclico limitado internamente que comprende un anillo de al menos seis aminoácidos para unirse específicamente a un ligando diana, donde el anillo comprende dos dominios de aminoácido, comprendiendo cada dominio aminoácidos formadores de epítopo y dos grupos funcionales en asociación que son las cadenas laterales de los aminoácidos en asociación o las cadenas laterales modificadas de los aminoácidos o grupos en asociación añadidos a la cadena lateral del aminoácido en asociación, donde los grupos funcionales en asociación están ubicados de modo que forman una o más asociaciones intracíclicas no covalentes; por medio del cual el oligopéptido cíclico está limitado en una conformación única de modo que los aminoácidos formadores de epítopo forman un epítopo en cada dominio, siendo cada epítopo capaz de unirse específicamente a un ligando diana; y donde el oligopéptido comprende dos epítopos; y cada grupo funcional en asociación es una cadena de hidrocarburo C8-C20 que puede estar saturada o insaturada, una cadena lineal o una cadena ramificada y sustituida o insustituida; y donde el oligopéptido cíclico tiene la estructura seleccionada de las estructuras siguientes:**Fórmula**

donde A, B, C, X, Y y Z representan los aminoácidos formadores de epítopos; A y X representan aminoácidos D y B, C, Y y Z representan aminoácidos L o A y X representan aminoácidos L y B, C, Y y Z representan aminoácidos D; se forma un epítopo con el dominio A-B y se forma un epítopo con el dominio Z-X-Y; y cada Σ representa un aminoácido en asociación; y**Fórmula**

donde , B, C, D, W, X, Y y Z representan los aminoácidos formadores de epítopo; se forma un epítopo con el dominio D-C-A-B y se forma un epítopo con el dominio Z-X-Y-W; y cada Σ representa un aminoácido en asociación.

Péptidos La presente invención se refiere a un oligopéptido cíclico limitado internamente, a una composición farmacéutica que comprende dicho oligopéptido, a usos de dicho oligopéptido y a una composición farmacéutica en medicina y a un procedimiento para producir dicho oligopéptido.

Antecedentes de la invención Se sabe que normalmente los receptores proteicos se unen a sus ligandos diana a través de epítopos, combinaciones de aminoácidos, que constituyen una pequeña proporción de la molécula proteica total.

Los receptores proteicos sobre la superficie de células a menudo son estimulados para producir una señal en el interior de la célula como resultado de la unión a otras proteínas, denominadas ligandos proteicos. La porción del ligando que interacciona con el receptor se denomina epítopo y normalmente constituye una combinación de un número pequeño de aminoácidos en estrecha proximidad entre sí, sujeto sobre la estructura de la cadena peptídica. Ejemplos de epítopos son las estructurar sobre la superficie de las proteínas que interaccionan con anticuerpos o con receptores de linfocitos T pero, de hecho, cualquier estructura sobre la superficie de una proteína que es reconocida específicamente por otra puede entrar dentro de la definición de un epítopo. Dado que la unión de un receptor de proteína con un epítopo puede ser una etapa importante en la etiología de una enfermedad o, por el contrario, en el tratamiento de un estado de enfermedad, la identificación de grupos funcionales que forman epítopos es un camino potencialmente fructífera para el desarrollo de nuevos fármacos, cuando el fármaco es un agente que comprende un epítopo que se une al receptor.

Existen dos retos que dificultan este abordaje al desarrollo de nuevos fármacos. Uno es la identificación de epítopos que se pueden usar como moléculas farmacológicas para unirse a receptores adecuados con el fin de tratar una enfermedad. El segundo reto es diseñar moléculas que pueden retener y presentar la combinación de aminoácidos que forman el epítopo de forma que se pueda conseguir una fuerte interacción de unión con un receptor celular.

Mihara et al, Bull. Chem Soc. Jpn, 65, 228 -333 (1992) divulgan la síntesis de [ácido L-d-aminomirístico] gramicidina S y su interacción con una bicapa fosfolipídica.

Sasaki et al, Peptide Science 1998, 1999, p 421 -424 divulgan análogos de la gramicidina S portadores de cuatro Lalquilglicinas y dos D-1-naftilaminas.

Nishino et al, Chemistr y Letters, pág. 665 -668, 1992 divulgan un hexapéptido cíclico lipófilo para electrodos selectivos de iones de calcio.

Se conocen procedimientos para identificar la combinación de aminoácidos que pueden formar epítopos. En la química combinatoria tradicional, la identificación de la secuencia más favorable para unirse a un receptor específico debe llevarse a cabo mediante la síntesis de cientos de posibles combinaciones de diferentes grupos, tales como aminoácidos, en órdenes diferentes, teniendo que analizarse en cada uno su eficacia. Este procedimiento requiere tiempo, es caro y está limitado por la naturaleza de la química que se puede realizar en la unión de los diferentes componentes juntos.

El documento WO 01/01140 proporciona un mejor modo de identificación de epítopos. Se proporciona una composición para interaccionar con un ligando. La composición comprende un ensamblaje no covalente de una pluralidad de conjugados distintos, comprendiendo cada conjugado un grupo de cabeza y un grupo de cola. Los grupos de colar de los conjugados forman una agregación hidrofóbica y los conjugados tienen libertad de movimiento unos respecto de otros dentro del ensamblaje de modo que, en presencia de un ligando, al menos dos de los grupos de cabeza están colocados adecuadamente para formar un epítopo capaz de interaccionar con el ligando más fuertemente que cada uno de los grupos de cabeza individualmente. La pluralidad de los conjugados que tiene la actividad biológica deseada se puede identificar seleccionando un conjunto de conjugados con una disposición de los grupos de cabeza formando una asociación no covalente de ellos, donde los grupos de cola se agregan hidrofóbicamente y donde los conjugados exhiben libertad de movimiento unos con respecto de otros y analizando una interacción suficiente entre la asociación no covalente y e ligando. Este procedimiento se puede repetir con una matriz modificada de grupos de cabeza con el fin de producir una interacción suficiente entre la asociación no covalente y el ligando. Este procedimiento permite la identificación de la secuencia más favorable para la unión a un receptor específico dependiendo de la proximidad de los grupos de cabeza para proporcionar epítopos derivados de la asociación sin la necesidad de la síntesis de cientos de posibles combinaciones de grupos diferentes usando química combinatoria tradicional. El procedimiento simplemente depende de la proximidad de los grupos de cabeza para proporcionar epítopos derivados de la asociación. Una vez que se ha sintetizado un conjunto de conjugados no se requiere una química sintética adicional, sólo mezclar simplemente los conjugados para formar las diferentes sondas mediante asociación no covalente.

Aunque esta nueva composición y procedimiento han tenido éxito para identificar los grupos funcionales que forman el epítopo y se unen al ligando diana, sigue existiendo un requisito de proporcionar mejores composiciones que sean capaces de formar el epítopo deseado e interaccionar con una mejor estabilidad y especificidad con el ligando diana para producir una respuesta biológica.

Los intentos para producir un péptido análogo al epítopo construido únicamente de los aminoácidos que comprenden el sitio de unión suelen fallar porque estos péptidos no poseen la misma actividad biológica que el receptor proteico.

Cuando el sitio de unión de una proteína está formado por oligopéptidos de diferentes partes no contiguas de una cadena proteica, los intentos para reconstruir el sitio de unión mezclando oligopéptidos aislados en solución libre no tienen como resultado el sitio de unión activo.

De acuerdo con esto, la presente invención está dirigida a proporcionar mejores oligopéptidos que son capaces de formar un epítopo deseado, que pueden interaccionar con una mejor estabilidad y especificidad con el ligando diana para producir una respuesta biológica.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un ensayo de detección selectiva para determinar la interacción entre un oligopéptido cíclico y un ligando diana como se define en la reivindicación 1.

La invención también proporciona un oligopéptido cíclico limitado internamente como se define en la reivindicación 14.

En la técnica se conoce que los péptidos cíclicos tienen una conformación que es más restringida que los oligopéptidos lineales. La libertad de movimientos de los extremos del péptido está limitada en un péptido cíclico porque están anclados juntos químicamente. No obstante, los péptidos cíclicos todavía tienen un grado considerable de flexibilidad que los convierte en inadecuados para participar en interacciones de unión estables con un ligando diana.

Construyendo oligopéptidos cíclicos con dos o más grupos funcionales en asociación colocados de modo que formen una o más asociaciones intracíclicas, el oligopéptido cíclico está limitado internamente en una conformación única, Esto permite que los aminoácidos que forman un epítopo en cada dominio se unan específicamente a un ligando diana con más estabilidad y especificidad que las disponibles hasta ahora. Los aminoácidos que forman el epítopo son capaces de formar un epítopo estable para interaccionar con un ligando para inducir una respuesta biológica. Dado que el epítopo se forma de un modo estable, existe una interacción mejorada con el ligando diana.

El documento US 2005/0107289 divulga agentes antimicrobianos y composiciones que incluyen péptidos cíclicos que tienen una secuencia de aminoácidos de D-y L-α-aminoácidos o β-aminoácidos. Se cree que este documento divulga además que los péptidos cíclicos se autoensamblan en estructuras supramoleculares dentro o por asociación con membranas microbianas. Dichas estructuras supramoleculares pueden ser, por ejemplo, nanotubos. Cada nanotubo tiene un poro en el centro del tubo que está rodeado por una serie de estructuras peptídicas de los péptidos cíclicos apilados. Los iones y las moléculas pequeñas pueden viajar a través de los poros de los nanotubos.

El documento US 2005/0107289 no divulga que los péptidos cíclicos comprenden aminoácidos formadores de epítopos que forman... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo de detección selectiva para determinar la interacción entre un oligopéptido cíclico y un ligando diana, donde el oligopéptido cíclico es un oligopéptido cíclico limitado internamente que comprende un anillo de al menos 5 seis aminoácidos para unirse específicamente a un ligando diana, donde el anillo comprende dos dominios de aminoácido, comprendiendo cada dominio aminoácidos formadores de epítopo y dos grupos funcionales en asociación que son las cadenas laterales de los aminoácidos en asociación o las cadenas laterales modificadas de los aminoácidos o grupos en asociación añadidos a la cadena lateral del aminoácido en asociación, donde los grupos funcionales en asociación están ubicados de modo que forman una o más asociaciones intracíclicas no 10 covalentes; por medio del cual el oligopéptido cíclico está limitado en una conformación única de modo que los aminoácidos formadores de epítopo forman un epítopo en cada dominio, siendo cada epítopo capaz de unirse específicamente a un ligando diana; y donde el oligopéptido comprende dos epítopos; y cada grupo funcional en asociación es una cadena de hidrocarburo C8-C20 que puede estar saturada o insaturada, una cadena lineal o una cadena ramificada y sustituida o insustituida; y donde el oligopéptido cíclico tiene la estructura seleccionada de las estructuras siguientes:

donde A, B, C, X, Y y Z representan los aminoácidos formadores de epítopos; A y X representan aminoácidos D y B,

C, Y y Z representan aminoácidos L o A y X representan aminoácidos L y B, C, Y y Z representan aminoácidos D; se forma un epítopo con el dominio A-B y se forma un epítopo con el dominio Z-X-Y; y cada Σ representa un aminoácido en asociación; y

donde , B, C, D, W, X, Y y Z representan los aminoácidos formadores de epítopo; se forma un epítopo con el dominio D-C-A-B y se forma un epítopo con el dominio Z-X-Y-W; y cada Σ representa un aminoácido en asociación.

2. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con la reivindicación 1, donde cada dominio del oligopéptido cíclico comprende tres aminoácidos formadores de epítopo y los tres aminoácidos formadores de epítopo tienen configuraciones estereoquímicas alternas y/o donde los aminoácidos son aminoácidos de origen natural, análogos de aminoácidos o formas D de los mismos.

3. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde cada aminoácido formador de epítopo adyacente a un grupo funcional en asociación tiene la misma configuración estereoquímica que el grupo funcional en asociación adyacente.

4. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde los epítopos son iguales. 40

5. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, donde los aminoácidos en asociación son aminoácidos lipídicos, donde, opcionalmente, al menos uno de los grupos funcionales en asociación portados sobre los aminoácidos lipídicos es una cadena lateral de hidrocarburo de C8-C20 o donde la cadena lateral del hidrocarburo lineal es una cadena lateral del hidrocarburo de C10-C16.

6. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, donde el aminoácido en asociación es cisteína y el grupo funcional en asociación es una cadena de hidrocarburo alifático C8-C20 unida al grupo sulfhidrilo de la cadena lateral de la cisteína.

7. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el dominio Z-X-Y y/o el dominio C-A-B se seleccionan de las secuencias de aminoácidos RFS, RSF, FSR, FRS, SRF,

SFR, QLS, QSL, SQL, SLQ, LQS o LSQ y cada Σ es un aminoácido lipídico con un grupo funcional en asociación de la cadena lateral de hidrocarburo lineal de C10 que comprende una cadena del hidrocarburo entre 8 y 20 carbonos de longitud.

8. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el dominio Z-X-Y y/o el dominio C-A-B forman un epítopo capaz de suprimir la secreción de TNF.

9. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el dominio Z-X-Y es RFS y/o el dominio Z-X-Y y el dominio C-A-B forman cada uno un epítopo capaz de suprimir la secreción de TNF.

10. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con la reivindicación 9, donde la fenilalanina tiene una configuración D, la serina tiene una configuración L, la arginina tiene una configuración L y cada aminoácido lipídico tiene una configuración L.

11. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el dominio C-A-B es igual al dominio Z-X-Y.

12. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con la reivindicación 1, donde el dominio Z-X-Y-W y/o el dominio D-C-A-B se seleccionan de las secuencias de aminoácidos YEKA, YEAK, YAKE, YAEK, YKAE, YKEA, EYKA, EYAK, EKAY, EKYA, EAKY, EAYK, KAYE, KAEY, KYAE, KYEA, KEAY, KEYA, AKEY, AKYE, AYEK, AYKE, AEYK o AEKY y cada Σ es un aminoácido lipídico con un grupo funcional en asociación en la cadena lateral de hidrocarburo lineal que comprende una cadena de hidrocarburo de una longitud de entre 8 y 20 carbonos; y donde, preferentemente, el dominio Z-X-Y-W es YEKA y el dominio D-C-A-B es EYAK y/o donde el dominio Z-X-Y-W y el dominio D-C-A-B forman cada uno un epítopo capaz de inhibir la actividad proteolítica y, opcionalmente, el dominio D-C-A-B es igual que el dominio Z-X-Y-W.

13. Un ensayo de detección selectiva de acuerdo con la reivindicación 1, donde el oligopéptido cíclico comprende los aminoácidos serina, fenilalanina y arginina como los aminoácidos formadores de epítopo en al menos uno de los dominios y cada dominio forma un epítopo capaz de suprimir la secreción de TNF.

14. Un oligopéptido cíclico limitado internamente que comprende un anillo de al menos seis aminoácidos para unirse específicamente a un ligando diana, donde el anillo comprende dos dominios de aminoácido, comprendiendo cada dominio aminoácidos formadores de epítopo y dos grupos funcionales en asociación que son las cadenas laterales de los aminoácidos en asociación o las cadenas laterales modificadas de los aminoácidos o grupos en asociación añadidos a la cadena lateral del aminoácido en asociación, donde los grupos funcionales en asociación están ubicados de modo que forman una o más asociaciones intracíclicas no covalentes; por medio del cual el oligopéptido cíclico está limitado en una conformación única de modo que los aminoácidos formadores de epítopo forman un epítopo en cada dominio, siendo cada epítopo capaz de unirse específicamente a un ligando diana; y donde el oligopéptido comprende dos epítopos; y cada grupo funcional en asociación es una cadena de hidrocarburo C8-C20 que puede estar saturada o insaturada, una cadena lineal o una cadena ramificada y sustituida o insustituida; y donde el oligopéptido cíclico tiene la estructura seleccionada de las estructuras siguientes:

donde A, B, C, X, Y y Z representan los aminoácidos formadores de epítopos; A y X representan aminoácidos D y B, C, Y y Z representan aminoácidos L o A y X representan aminoácidos L y B, C, Y y Z representan aminoácidos D; se forma un epítopo con el dominio A-B y se forma un epítopo con el dominio Z-X-Y; y cada Σ representa un aminoácido en asociación; y el dominio Z-X-Y y/o el dominio C-A-B se selecciona de las secuencias de aminoácidos RFS, RSF, FSR, FRS, SRF, SFR, QLS, QSL, SQL, SLQ, LQS o LSQ y cada ∑ es un aminoácido lipídico; y

donde , B, C, D, W, X, Y y Z representan los aminoácidos formadores de epítopo; se forma un epítopo con el dominio D-C-A-B y se forma un epítopo con el dominio Z-X-Y-W; cada E representa un aminoácido en asociación,

donde el dominio Z-X-Y-W y/o el dominio D-C-A-B se selecciona de las secuencias de aminoácidos YEKA, YEAK, YAKE, YAEK, YKAE, YKEA, EYKA, EYAK, EKAY, EKYA, EAKY, EAYK, KAYE, KAEY, KYAE, KYEA, KEAY, KEYA, AKEY, AKYE, AYEK, AYKE, AEYK o AEKY y cada ∑ es un aminoácido lipídico.

15. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con la reivindicación 14, donde cada dominio comprende tres aminoácidos formadores de epítopo y los tres aminoácidos formadores de epítopo tienen configuraciones estereoquímicas alternas y/o donde los aminoácidos son aminoácidos de origen natural, análogos de aminoácidos o formas D de los mismos.

16. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, donde cada aminoácido formador de epítopo adyacente a un grupo funcional en asociación tiene la misma configuración estereoquímica que el grupo funcional en asociación adyacente.

17. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, donde los epítopos son iguales. 20

18. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, donde el grupo funcional en asociación es una cadena lateral de hidrocarburo de C8-C20 o donde la cadena lateral del hidrocarburo lineal es una cadena lateral del hidrocarburo de C10-C16.

19. Un aminoácido cíclico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, donde el aminoácido en asociación es cisteína y el grupo funcional en asociación es una cadena de hidrocarburo alifático C8-C20 unida al grupo sulfhidrilo de la cadena lateral de la cisteína.

20. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde el dominio Z-X-Y y/o el 30 dominio C-A-B forman un epítopo capaz de suprimir la secreción de TNF.

21. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, donde el dominio Z-X-Y es RFS y/o donde el dominio Z-X-Y y el dominio C-A-B forman cada uno un epítopo capaz de suprimir la secreción de TNF.

22. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con la reivindicación 21, donde la fenilalanina tiene una configuración D, la serina tiene una configuración L, la arginina tiene una configuración L y cada aminoácido lipídico tiene una configuración L.

23. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el dominio C-A-B es igual al dominio Z-X-Y.

24. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con cualquiera la reivindicación 14, donde el dominio Z-X-Y-W es YEKA y el

dominio D-C-A-B es EYAK y/o donde el dominio Z-X-Y-W y el dominio D-C-A-B forman cada uno un epítopo capaz 45 de inhibir la actividad proteolítica y, opcionalmente, el dominio D-C-A-B es igual que el dominio Z-X-Y-W.

25. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende los aminoácidos serina, fenilalanina y arginina como los aminoácidos formadores de epítopo en al menos uno de los dominios y cada dominio forma un epítopo capaz de suprimir la secreción de TNF.

26. Un oligopéptido cíclico de acuerdo con las reivindicaciones 14 a 25 para uso como medicamento, profiláctico o diagnóstico.