MICROORGANISMO CAPAZ DE CONVERTIR ÁCIDO ELÁGICO Y ELAGITANINOS EN UROLITINAS Y USO DEL MISMO.

La presente invención se refiere a la identificación por primera vez de microorganismos de origen gastrointestinal humano,

que pueden producir urolitinas, a procedimientos de producción de dichos compuestos, al uso de dichos compuestos así producidos en la elaboración de formulaciones alimenticias, farmacéuticas, complementos dietéticos o alimentarios y alimentos funcionales, así como la elaboración de composiciones probióticas mediante la incorporación de microorganismos productores de urolitinas y a un método de aislamiento, de detección y de cuantificación de microorganismos productores de urolitinas basado en el uso de un fragmento de ADN capaz de detectar específicamente los microorganismos productores de urolitinas.

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

P201330400

1. Microorganismos capaces de producir urolitinas caracterizados porque:

(i) Se seleccionan a partir de muestras biológicas de individuos productores de 5 urolitinas, (ii) Son capaces de crecer en un medio de cultivo apropiado que contiene ácido elágico y/o elagitaninos , (iii) Son capaces de produccir urolitinas cuando se incuban en medio de cultivo (ii) , durante un periodo de tiempo determinado y suficiente, en condiciones de 10 atmósfera y temperatura adecuadas, (iv) Las urolitinas producidas pueden determinarse mediante técnicas adecuadas, y porque pertenecen a especies bacterianas del género Gordonibacter seleccionadas entre Gordonibacter sp. CEBAS 1/15P (DSM 26536) o Gordonibacter pamelaeae (DSM 19378) .

2. Microorganismos capaces de producir urolitinas según la reivindicación anterior caracterizados porque dicha selección (i) se realiza a partir de muestras biológicas de individuos (humanos o animales) productores de urolitinas tales como heces, contenidos del tracto digestivo como colon descendente, ciego u otros.

3. Microorganismos productores de urolitinas según reivindicación anterior caracterizados porque dicha selección (i) se realiza a partir de muestras procedentes de individuos productores de urolitinas que se someten a un cribado mediante subcultivo en medio de crecimiento líquido.

4. Microorganismos productores de urolitinas según reivindicación 1 caracterizado porque dicha (ii) capacidad de crecer en medio que contiene ácido elágico y/o elagitaninos se establece preferentemente mediante cultivo en medio líquido suplementado con ácido elágico y/o elagitaninos en una concentración final de entre 3 y 30 μM.

5. Microorganismos productores de urolitinas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha (ii) capacidad de crecer en medio que contiene ácido elágico y/o elagitaninos se realiza en un medio que contiene componentes adecuados, como sacáridos y fuente de nitrógeno y que no contenga componentes que inhiban la capacidad de producción de urolitinas o la proliferación de los microorganismos de la presente invención.

Entre los componentes del medio de cultivo se pueden encontrar componentes tales como peptona, peptona tripticasa, extracto de levadura, hemina, histidina, vitaminas, como la P201330400

vitaminas K, L-cisteína, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, (NH4) 2SO4, CaCl2, MgSO4, glúcidos y fibras. Alternativamente podrían sustituirse los componentes del medio excepto el ácido elágico y/o elagitaninos y la arginina utilizando el medio Wilkins-chalgren, medio basal para anaerobios, el medio BHI, el medio DRCM, u otros.

6. Microorganismos productores de urolitinas según reivindicación 1 caracterizados porque dicha (iii) capacidad de producir urolitinas cuando se incuban en medio de cultivo (ii) , durante un periodo de tiempo determinado y suficiente, en condiciones de atmósfera y temperatura adecuadas, tiene lugar preferentemente durante un tiempo de entre 20 y 300

horas, a una temperatura de entre 28 y 40 º C y en una atmosfera que contenga concentraciones de N2:H2:CO2 que garanticen la ausencia de O2, o cualquiera de las combinaciones posibles de tiempo, atmósfera y temperatura indicadas.

7. Microorganismos productores de urolitinas según reivindicación anterior caracterizados porque dicha (iii) capacidad de producir urolitinas cuando se incuban en medio de cultivo (ii) , durante un periodo de tiempo determinado y suficiente, en condiciones de atmósfera y temperatura adecuadas, tiene lugar preferentemente a una temperatura de 37 º C, en una atmosfera de N2:H2:CO2 = 80:10:10, y durante un periodo de entre 40 y 175 horas.

8. Microorganismos productores de urolitinas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dichas especies bacterianas son capaces de crecer en medios de crecimiento líquidos o sólidos y metabolizar compuestos fenólicos de la dieta.

9. Procedimiento de producción de urolitinas basado en la utilización de los microorganismos productores de urolitinas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

(i) Inoculación del microorganismo productor de urolitinas en medio líquido suplementado con ácido elágico y/o elagitaninos para generar el cultivo (ii) Incubación del cultivo durante un periodo de tiempo adecuado y suficiente, en condiciones de atmósfera y temperatura adecuadas (iii) Extracción y purificación de las urolitinas producidas.

10. Procedimiento de producción de urolitinas según reivindicación anterior caracterizado 35 porque dicha inoculación del microorganismos en medio líquido (i) se realiza P201330400

preferentemente en un medio según reivindicación 5 suplementado con ácido elágico y/o elagitaninos según reivindicación 4.

11. Procedimiento de producción de urolitinas según reivindicación 9 caracterizado porque dicha Incubación (ii) del cultivo durante un periodo de tiempo adecuado y suficiente, en condiciones de atmósfera y temperatura adecuadas, se realiza preferentemente según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7.

12. Procedimiento de producción de urolitinas según reivindicación 9 en la que la dicha extracción y purificación (iii) de las urolitinas producidas en el medio de cultivo se realiza mediante un proceso de extracción con plasma o un proceso de purificación convencional tales como cromatografía en columna o la extracción con disolvente orgánico u otros procedimientos de extracción y purificación conocidos y aplicables.

13. Procedimiento para el aislamiento de microorganismos productores de urolitinas a partir de muestras biológicas caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

(i) Recogida de colonias de bacterias crecidas en medio de cultivo sólido

(ii) Subcultivo de las colonias aisladas en medio de cultivo líquido suplementado con ácido elágico o elagitaninos

(iii) Incubación de los medios inoculados a temperatura y tiempo adecuados, en condiciones de atmosfera adecuada

(iv) Extracción del medio de cultivo con un disolvente orgánico

(v) Adsorción en columna de intercambio iónico y elución con metanol

(vi) Análisis de las urolitinas producidas mediante HPLC un otros medios de análisis como RMN u otros.

14. Polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad de al menos un 90 % frente a la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1 ó 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 ó 7 ó 8 ó 9 ó 10 ó 11º a su complementaria.

15. Polinucleótido según reivindicación anterior cuya secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad de al menos un 95 % frente a la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1 ó 2ó3 ó4ó5 ó6ó7ó 8ó9 ó10 ó 11 o a su complementaria.

P201330400

16. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14 y 15 cuya secuencia de nucleótidos es la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1 ó 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 ó 7 ó 8 ó 9 ó 10 ó 11º su complementaria.

17. Procedimiento de aislamiento e identificación de microorganismos productores de urolitinas caracterizado por la utilización de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para dicho aislamiento e identificación mediante hibridación por técnicas tales como la hibridación in situ, la hibridación dot blot, la hibridación southern blot u otros métodos de hibridación con el material genético de las bacterias de una muestra biológica.

18. Procedimiento de aislamiento e identificación de microorganismos productores de urolitinas, según reivindicación anterior, caracterizado por la utilización del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, mediante hibridación in situ se realiza preferentemente mediante métodos tales como el método FISH, empleando dicho polinucleótido marcado con un tinte fluorescente u otros marcadores.

19. Procedimiento de identificación y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas, a través del contaje las células marcadas caracterizado por la utilización del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, mediante hibridación in situ que se realiza mediante métodos tales como el método FISH, empleando dicho polinucleótido marcado con un tinte fluorescente u otros marcadores.

20. Procedimiento para el aislamiento, identificación y cuantificación de microorganismos 25 productores de urolitinas caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

(i) Extracción de ácidos nucleicos totales de los microorganismos candidatos (ADN o ARN)

(ii) Amplificación mediante PCR convencional o a tiempo real

(iii) Correlación de los resultados de la amplificación con la amplificación del 30 microorganismo productor de urolitinas.

21. Procedimiento para el aislamiento, identificación y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas según reivindicación anterior caracterizado porque en dicha amplificación (ii) mediante PCR a tiempo real cuantitativa se correlacionan los resultados de la amplificación con el número de células del microorganismo productor de urolitinas.

P201330400

22. Procedimiento para el aislamiento, identificación y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas según reivindicación 20 caracterizado porque dicha amplificación (i) mediante PCR se hace utilizando como cebadores dos oligonucleótidos seleccionados entre los oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 3 ó 4, ó 5, ó 6 o sus complementarios u oligonucleótidos que presentan un grado de identidad de secuencia superior al 90 % con dichas secuencias o cualquiera de sus combinaciones.

23. Procedimiento para el aislamiento, identificación y cuantificación de microorganismos productores de urolitinas según reivindicación 20 caracterizado porque dicha amplificación (ii) mediante PCR a tiempo real cuantitativa se hace utilizando como sonda TaqMan un polinucleótido cuya secuencia es la secuencia identificada como SEQ ID. NO: 7 o su complementaria o un polinucleótido que presenta un grado de identidad de secuencia superior al 90 % con dicha secuencia.

24. Método de identificación de individuos que contienen microorganismos capaces de producir urolitinas, caracterizado porque se obtienen muestras de heces o contenidos del tracto digestivo como colon descendente, ciego u otros en cantidad adecuada y se somete al procedimiento para el aislamiento e identificación de microorganismos productores de urolitinas según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, o a un procedimiento de identificación y cuantificación según reivindicación 19, o se extrae ADN total de dichas muestras, mediante métodos convencionales y una dilución apropiada de dicho ADN se somete al procedimiento de aislamiento, identificación y cuantificación según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.

25. Sistema de producción de urolitinas caracterizado porque se utilizan los microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o los microorganismos aislados por el procedimiento descrito según reivindicación 13, o los microorganismos aislados e identificados por los procedimientos descritos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o los microorganismos aislados identificados y cuantificados cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.

26. Sistema de producción de urolitinas según reivindicación anterior caracterizado porque las urolitinas se producen preferentemente por el sistema descrito según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 o por un sistema de producción in vitro basado en el uso cualquiera de las células viables o células térmicamente desnaturalizados (células muertas) de dichos microorganismos o sus enzimas, o productos de dichos microorganismos tales

P201330400

como un producto liofilizado, un producto de cultivo (por ejemplo, sobrenadante de cultivo) , un producto de células tratadas, u otro producto donde el microorganismo se emplea preferiblemente en un estado en que se inhiba la inactivación de sus enzimas.

27. Urolitinas producidas según cualquiera de las reivindicaciones 25 o 26.

28. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales que contienen urolitinas según reivindicación anterior.

29. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales con un microorganismo productor de urolitinas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un microorganismo aislado por el procedimiento descrito según la reivindicación 13, o los microorganismos aislados e identificados por los procedimientos descritos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.

30. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según reivindicación anterior caracterizados por que contienen células viables o células térmicamente desnaturalizadas de dicho microorganismo, o un producto liofilizado del mismo, o un producto de cultivo (por ejemplo, sobrenadante de cultivo que contenga urolitinas sin contener el microorganismo) , u otros, siempre y cuando las células o productos derivados de los microorganismos se empleen en un estado en el que se inhiba la inactivación de sus enzimas.

31. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30 caracterizados por que además de dicho microorganismo o sus productos contienen ácido elágico.

32. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según reivindicación anterior caracterizados por que contienen además, o en vez de ácido elágico, elagitaninos tales como por ejemplo la punicalagina de la granada, los elagitaninos de las nueces, las fresas, las frambuesas, plantas medicinales, así como tejidos vegetales ricos en elagitaninos (hoja de roble, bellotas etc) , entre otros.

P201330400

33. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 caracterizados por que además de dicho microorganismo o sus productos contienen metabolitos intermedios de conversión del ácido elágico a urolitina A, por ejemplo, urolitina M5, urolitina D, u otras.

34. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 caracterizados por que además de dicho microorganismo o sus productos, contienen un producto natural que contenga una gran cantidad de elagitaninos o uno de sus productos procesados. Dichos productos pueden ser preferentemente productos tales como granada, nueces, fresas, castañas, moras, frambuesas, u otros. Dichos productos procesados pueden incluir preferentemente productos tales como el zumo de granada, el zumo de fresa u otros zumos o derivados de cualquier producto rico en elagitaninos.

35. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34 que se administra por vía oral sin modificar o mezclada con aditivos y/o componentes nutricionales por medios convencionales que pueden añadirse a un alimento o bebida, de forma adecuada para poder comerse o beberse.

36. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones probióticas y/o alimentos funcionales según reivindicación anterior caracterizada por que se presenta en forma de gránulos, partículas, comprimidos, cápsulas, pasta u otros, que se añaden entre otros a alimentos tales como productos cárnicos procesados (tales como por ejemplo, jamón y salchichas) u otros, a productos de pescado (tales como por ejemplo, kamaboko y chikuwa) u otros, a pan, productos de confitería, mantequilla, leche en polvo y leche fermentada, o se añaden a bebidas tales como agua, zumo y néctar de frutas, mermelada, leche, refrescos, bebidas a base de té o sus combinaciones, u otros.

37. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34 que se administran por vía oral, rectal o parenteral mediante mezcla de dichas composiciones con un portador farmacéutico no tóxico sólido o líquido, seleccionado dependiendo del método de administración (por ejemplo, administración oral, administración rectal, o por inyección) , para producir con ello una preparación farmacéutica común.

P201330400

38. Composiciones farmacéuticas según reivindicación anterior que pueden presentarse en preparaciones sólidas tales como tabletas, gránulos, polvo, y cápsulas, preparaciones líquidas tales como soluciones, suspensiones, y emulsiones, jarabes y preparaciones liofilizadas, producidas a través de un método de fabricación común. Que contienen un 5 vehículo farmacéutico no tóxico tales como cualquier seleccionado de entre almidón, dextrina, glicérido de ácido graso, polietilenglicol, almidón de hidroxietilo, etilenglicol, aminoácido, agua, gelatina, albúmina, solución salina fisiológica u otros. En caso necesario, las composiciones pueden contener aditivos comunes tales como un estabilizador, un agente humectante, un emulsionante, un aglutinante, un agente de tonicidad, y/o un excipiente, entre otros.

39. Composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 36, o composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 38, para la alimentación y/o tratamiento de individuos humanos y/o animales.

40. Utilización de las composiciones alimenticias, bebidas, complementos dietéticos, composiciones farmacéuticas, probióticas y/o alimentos funcionales según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 39 para elevar el nivel de urolitinas in vivo, en el organismo, la sangre, el intestino (por ejemplo, el intestino grueso) , preferentemente para el tratamiento, mejora, prevención, etc de una variedad de enfermedades y trastornos tales como entre otros la arteriosclerosis y otras enfermedades cardiovasculares, cáncer de mama, cáncer de próstata, enfermedades inflamatorias intestinales y síndrome premenstrual u otros.