Métodos y moléculas inmunoterapéuticos.

Un péptido de menos de 5000 de peso molecular que comprende la secuencia aminoácida FHTYTIDWTKDAVTW donde el péptido es capaz de unirse a HLA-DRB1*04 y donde cuando está unido a HLADRB1*04 el HLA-DRB1*04 unido al péptido es capaz de identificar células T específicas para Aspergillus fumigatus.

Métodos y moléculas inmunoterapéuticos.

La presente invención se refiere a métodos inmunoterapéuticos, y moléculas y células para usar en métodos inmunoterapéuticos. En particular, la presente invención se refiere a la inmunoterapia de la infección Aspergillus, que incluye la inmunoterapia adoptiva.

El listado o discusión de un documento aparentemente antes publicado en esta especificación no debería ser necesariamente tomado como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la técnica o es de conocimiento general.

Las complicaciones infecciosas son la causa principal de muerte en individuos inmunosuprimidos e inmunocomprometidos, que incluyen pacientes que reciben trasplantes de células madre hemotopoyéticas alogénicas (HSCT) . Las micosis sistémicas son muy frecuentes y también los patógenos más perjudiciales que invaden pacientes 1, 2 con inmunodeficiencias. Aspergillus fumigatus es el hongo más importante en este subgrupo, causando sobre todo infecciones invasivas de la orofaringe y el sistema respiratorio con una mortalidad de hasta el 80% en algunas cohortes3 de pacientes. Con el avance de nuevas modalidades de tratamiento para ofrecer a pacientes no médicamente aptos de otro modo una HSCT alogénica potencialmente curativa, la incidencia de Aspergillosis Invasiva (IA) y la mortalidad atribuída a ella se ha incrementado más en los últimos años. Este cambio epidemiológico se observó a pesar del amplio uso de nueva quimioterapia antifúngica tal como voriconazol 3, 4. Por tanto están altamente garantizadas opciones más eficaces de prevención y tratamiento para el control de infecciones A. fumigatus en pacientes que experimentan HSCT alogénico.

Aspergillus es un grupo de alrededor de 200 especies de moho halladas en todo el mundo. Como está distribuído por doquier, se estima que los humanos inhalan presuntamente varios cientos de conidios de Aspergillus cada dia. Algunas de las especies de Aspergillus se asocian con enfermedades infecciosas patógenas en humanos y animales, que incluyen Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus y Aspergillus flavus. La enfermedad alérgica se atribuye principalmente a A. fumigatus y A. clavatus. Aspergillus fumigatus es un hongo filamentoso y saprófito que sobre todo se encuentra en la tierra.

A pesar del constante contacto con patógenos, los individuos sanos en general no desarrollan infecciones sintomáticas de Aspergillus lo que implica que una respuesta inmune local eficaz debe ser existente y capaz de quitar la infección5. La primera línea de defensa para evitar que los conidios de A. fumigatus se conviertan en hifas invasivas patógenas son macrófagos alveolares que fagocitan conidios inhalados y eliminan el patógeno mediante intermedios intracelulares reactivos con oxígeno (ROI) 6, 7. Si A. fumigatus sin embargo comenzara a invadir al huésped comenzando la germinación, la segunda línea de defensa innata se activa. Granulocitos neutrofílicos se adhieren a la pared hifal y liberan tanto ROI como enzimas hidrolíticas en proximidad cercana al hongo dando lugar a un daño irreparable a la pared fúngica6.

En receptores de SCT alogénica múltiples factores adversos contribuyen a la alta indicidencia de infecciones de A. Fumigatus. En primer lugar, la barrera epitelial y mucosal respiratoria es dañada considerablemente por los regímenes condicionantes dando lugar a germinación más extendida de conidios1 inhalados. En segundo lugar, los recuentos de granulocitos neutrofílicos se reducen transitoriamente en el paciente tratado resultando en una línea secundaria inferior de defensa innata. Los recuentos de granulocitos neutrofílicos se reconstituyen en promedio en el día 12-15 tras el trasplante de células madre periféricas alogénicas, conllevando una protección enormemente aumentada contra la infección bacteriana. Pero a pesar de esta temprana reconstitución neutrófila en receptores de HSTC alogénicas, el índice de infecciones fúngicas continua elevada durante los posteriores meses3, 4.

Una explicación potencial para esta observación es la supresión inmune prolongada llevada a cabo para la prevención y tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) , que implica que la inmunidad adaptativa puede también contribuir al control del IA. Esta hipótesis está reforzada por numerosos sistemas de modelo murino que muestran que la infección previa con dosis subletales de conidios de A. Fumigatus y otros antígenos fúngícos protege a los ratones contra la reexposición letal con el patógeno8-10. Además, la transferencia adoptiva de células T CD4+ procedentes de animales inmunizados transfiere inmunidad protectora a ratones receptores naive por lo demás susceptibles, enfatizando el papel crucial de la inmunidad adaptativa en la protección del huésped11.12. Además de estos datos, las condiciones de aplicación de experimentos con ratones que favorecen una respuesta celular TH1 o TH2 CD4+ T revelaron que solamente células TH1 CD4+ T protegieron al huésped de la exposición letal con Aspergillus, mientras que la inducción de respuestas TH2 a menudo agravaron la enfermedad8, 13.

El alérgeno de Aspergillus f16 ha sido el foco de estudios por otros, y se han investigado 27.28.48 inmunorespuestas a varios péptidos.

Trabajos recientes por el grupo de inventores usando extracto de A. fumigatus crudo así como trabajos realizados por otros grupos, demostraron que humanos sanos también presentan una respuesta de memoria para este hongo patógeno14-17. Como en roedores, la respuesta de células T está dominada por las células T CD4+ con un fenotipo sesgado por TH1.. Sin embargo, no ha sido posible hasta ahora convertir estos hallazgos básicos en aplicaciones medicas porque la población de células T de memoria específica para A. fumigatus no ha sido adicionalmente caracterizada por identificación de antígenos inmunogénicos.

Las enfermedades humanas asociadas con Aspergillus incluyen Aspergilosis Broncopulmonar Alérgica (ABPA) , Aspergilosis Invasiva (IA) , Aspergiloma, y sinusitis Aspergillus crónica. ABPA es causada por la presencia de Aspergillus en la región broncopulmonar que lleva a inflamación y respuestas alérgicas. Bronquiectasia y degeneración pulmonar a largo plazo se desarrolla con síntomas parecidos al asma. La Aspergilosis invasiva es asociada con inmunodeficiencias. La infección normalmente comienza en los pulmones y puede transferirse a otros órganos. La tasa de mortalidad asociada con IA es elevada. El aspergiloma aparece cuando otras afecciones crean cavidades en los pulmones que permite que las esporas de Aspergillus germinen y colonicen la zona, formando una bola fúngica. La enfermedad es a menudo crónica e incurable. La sinusitis Aspergillus crónica se desarrolla en el seno nasal de forma parecida al aspergiloma en los pulmones. Existe una creencia cada vez mayor de que muchos problemas sinusales crónicos son un resultado de reacciones alérgicas a los hongos.

Ramadan et al (2005) Clin. Exp. Immunology 139, 257-267 describe la generación de respuestas de células T TH1 dirigidas a un epítopo restringido de HLA de Class II del alergeno Aspergillus f16.

Banerjee et al (2001) Clin. Exp. Allergy 31, 761-770 describe la clonación y expresión del alergeno Aspergillus fumigatus Asp f16.

Presentamos datos sobre la identifcación del contexto de HLA en que un epítopo inmunodominante del antigeno Asp f16 se presenta para el reconocimiento del sistema inmune en humanos. Este es HLADRB1*04, el alelo MHC Clase II más abundante en la población humana y demostramos que dichas células T específicas de epítopo pueden ser activadas por células que presentan antigenos alimentados con conidios o hifas germinantes de A. fumigatus. Además también demostramos que células inmunes innatas pueden estar condicionadas por inmunidad de células T específcas de Aspergillus que resulta en la matanza aumentada de Aspergillus fumigatus por células inductoras innatas.

Sorprendentemente, hemos hallado que células T CD4+ específicas para el péptido restringido HLADRB1*04 que contienen el epítopo o un fragmento inmunogénico del mismo son específicamente activadas por la germinación de conidios e hifas de A. fumigatus, mientras que los conidios en reposo tienen únicamente capacidad estimulatoria limitada y otros patógenos fúngicos como Candida albicans fallan al inducir la activación..

Las células T CD4+ específicas de Aspergillus son útiles en terapia de células T adoptiva que puede ser beneficiosa en pacientes con evidencia de enfermedad relacionada con Aspergillus, o para terapia profiláctica o preventiva, por ejemplo en receptores de HSCT asintomátcios. El descubrimiento de la restricción... [Seguir leyendo]

1. Un péptido de menos de 5000 de peso molecular que comprende la secuencia aminoácida FHTYTIDWTKDAVTW donde el péptido es capaz de unirse a HLA-DRB1*04 y donde cuando está unido a HLADRB1*04 el HLA-DRB1*04 unido al péptido es capaz de identificar células T específicas para Aspergillus fumigatus.

2. Un péptido según la Reivindicación 1 donde el péptido incluyen uniones no peptídicas.

3. Un polipéptido que es una fusión del péptido de la Reivindicación 1 y otro péptido, donde el otro péptido es una cadena invariante de una molécula HLA y donde el péptido de las Reivindicaciones 1 o 2 es capaz de ocupar la ranura de unión del péptido de la molécula HLA.

4. Un complejo que comprende una molécula HLA-DRB1*04 de Clase II unida a un péptido, donde el péptido es un péptido de menos de 5000 de peso molecular que comprende la secuencia aminoácida FHTYTIDWTKDAVTW o una porción de al menos 11 aminoácidos de la secuencia aminoácida dada, o una variante de la secuencia aminoácida dada donde las cadenas laterales de uno o dos o tres residuos aminoácidos están alteradas, donde el péptido que comprende la porción, o variante, es capaz de unirse a HLA-DRB1*04, y donde cuando está unido a HLA-DRB1*04 el HLA-DRB1*04 unido al péptido es capaz de identificar células T específicas para Aspergillus fumigatus

5. Un complejo según la Reivindicación 4 que es un complejo soluble.

6. Uso in vitro de un complejo según las Reivindicaciones 4 o 5 para aislar una célula T específica de Aspergillus, o para identificar una célula T específica de Aspergillus en una muestra.

7. Un método para seleccionar células T específicas de Aspergillus, el método comprendiendo contactar una población de células T con un péptido presentado en una molécula HLADRB1* 04 Clase II in vitro, donde el péptido es un péptido como se define en la Reivindicación 4.

8. Un método según la Reivindicación 7 donde la molécula HLA Clase II está presente en la superficie de una célula que presenta antígeno.

9. Un complejo según la Reivindicación 4 o un método según la Reivindicación 7 u 8 donde la molécula HLA Clase II es una molécula HLA Clase II soluble sintética.

10. Un método según cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 9 donde la célula T específica de Aspergillus seleccionada es aislada.

11. Células T específicas de Aspergillus que son capaces de reconocer el péptido presentado por HLADRB1*04 como se define en la Reivindicación 4.

12. Un receptor de célula T (TCR) que detecta infección de Aspergillus, el TCR siendocobtenible de las células T específicas de Aspergillus de la Reivindicación 11, donde el TCR, reconoce moléculas MHC Clase II humanas expresadas en la superficie de una célula que presenta antígeno y cargadas con un péptido como se define en la Reivindicación 4.

13. Un TCR según la Reivindicación 12 que es un TCR de cadena sencilla de tres dominios.

14. Células T específicas de Aspergillus como se definen en la Reivindicación 11 o células T que comprenden un polinucleótido que codifica un TCR como se define en la Reivindicación 12 o una población de células T que se ha activado usando el péptido como se define en la Reivindicación 4 para uso en medicina, por ejemplo para uso en combatir la infección de Aspergillus, o para uso en combatir la alergía a Aspergillus, en un paciente, opcionalmente donde las células T específicas de Aspergillus son autólogas al paciente, o las células T son de un donante.

15. Un método para determinar la cantidad de células T específicas de Aspergillus en un individuo el método comprendiendo contactar una muestra de sangre del individuo con el complejo de la Reivindicación

4.

16. Un polinucleótido que codifica un péptido como se define en la Reivindicación 1 o un polipéptido según la Reivindicación 3 o un TCR como se define en la Reivindicación 12.

17. Una composición farmacéutica que comprende un péptido como se define en la Reivindicación 1 o un polipéptido según la Reivindicación 3 o un polinucleótido según la Reivindicación 16 o células T específicas de Aspergillus como se define en la Reivindicación 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Un péptido como se define en la Reivindicación 1 o un polipéptido según la Reivindicación 3 o un polinucleótido según la Reivindicación 16 para uso en medicina, preferiblemente donde el individuo a ser tratado es un individuo humano que tiene HLA-DRB1*04 Clase II, por ejemplo para uso para combatir la infección de Aspergillus o para combatir la alergia a Aspergillus.

19. Una vacuna contra infección de Aspergillus que comprende un péptido como se define en la Reivindicación 1 o un polipéptido según la Reivindicación 3 o un polinucleótido según la Reivindicación 16.

20. Una célula que presenta antígeno, tal como una célula dendrítica, que está presentando un péptido como se define en la Reivindicación 1 o un polipéptido según la Reivindicación 3, preferiblemente donde la célula que presenta antígeno tiene HLA-DRB1*04 Clase II.

21. Una célula que presenta antígeno según la Reivindicación 20 para uso en medicina, optionalmente como una vacuna contra infección de Aspergillus u optionalmente para uso en combatir infección de Aspergillus en un paciente, preferiblemente donde el paciente is uno que tiene HLA -DRB1*04 Clase II.

22. Un anticuerpo que selectivamente reconoce al péptido FHTYTIDWTKDAVTW cuando se presenta por HLA-DRB1*04 Clase II.

23. Un anticuerpo según la Reivindicación 22 para uso en medicina, tal como para uso en combatir la infección de Aspergillus, preferiblemente donde el receptor es uno que tiene HLA-DRB1*04 Clase II.

24. Un método in vitro de determinar si un individuo está infectado o no con Aspergillus, el método comprendiendo determinar si un individuo contiene células T específicas de Aspergillus como se define en la Reivindicación 11, preferiblemente donde el individuo es uno que tiene HLA-DRB1*04 Clase II.

25. Un método in vitro para determinar si un individuo está infectado con Aspergillus, el método comprendiendo usar un TCR según la Reivindicación 12, preferiblemente donde el individuo es uno que tiene HLA-DRB1*04 Clase II.