Método para reducir los efectos de las variaciones en la secuencia y los efectos de un incremento de la línea de base en un ensayo de hibridación de diagnóstico, ensayo para realizar tal método y sonda para uso en el ensayo.

Sonda fluorescible, en donde el vástago de la sonda comprende:

* uno o varios 2'-O-metil-nucleótidos, y

* uno o varios nucleótidos no modificados

Método para reducir los efectos de las variaciones en la secuencia y los efectos de un incremento de la línea de base en un ensayo de hibridación de diagnóstico, ensayo para realizar tal método y sonda para uso en el ensayo

La presente invención se refiere a un método para reducir el efecto de las variaciones en la secuencia en ensayos de hibridación de diagnóstico que utilizan una sonda de ácido nucleico para detectar una sustancia a analizar de ácido nucleico amplificado. La presente invención se refiere también a un método para reducir el efecto del IBL no deseado (aumento de la línea de base, del inglés “Increase of Base Line”) , que limita el uso de sondas fluorescibles en ensayos de hibridación de diagnóstico. La invención se refiere además a los ensayos así obtenidos, y a sondas para uso en tales ensayos, los ensayos de diagnóstico y las sondas que emplean al menos uno de estos dos métodos para reducir consecuencias no deseables sobre los resultados de diagnóstico. Muchos ensayos de diagnóstico se basan en la amplificación de una molécula de ácido nucleico o de parte de la misma con la ayuda de cebadores, y la detección del material amplificado por medio de una sonda. Bajo unas condiciones de reacción apropiadas, los cebadores se hibridan con la sustancia a analizar que se va a detectar, e inician la amplificación de la secuencia diana. Esto dará lugar a la generación de amplicones.

Entretanto se han desarrollado diversas técnicas de amplificación, como PCR, LCR, NASBA, TMA, RCR, 3SR y SDA, y son bien conocidas por el experto en la técnica. Una información adecuada sobre estas técnicas se puede encontrar en varios documentos:

• PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) , descrita en los documentos de patentes US-A-4.683.195, US-A

4.683.202 y US-A-4.800.159, y su derivado RT-PCR (PCR con transcripción inversa) , para llevar a cabo la amplificación del ARN, descrita particularmente en el documento EP-B-0.569.272,

• LCR (Reacción en Cadena de la Ligasa) , expuesta en el documento EP-A-0.201.184,

• NASBA (Amplificación Basada en la Secuencia de Ácidos Nucleicos) se describe en el documento WO-A91/02818, y

• TMA (Amplificación basada en la Transcripción) descrita en el documento de patente US-A-5.399.491,

• RCR (Reacción de Reparación en Cadena) expuesta en el documento de solicitud WO-A-90/01069,

• 3SR (Replicación de Secuencia Autoprolongada) bien explicada en el documento de solicitud WO-A-90/06995.

Durante o después de la amplificación de la sustancia a analizar o de parte de la misma, se debe detectar la presencia o la cantidad de amplicones generados. Esto se puede realizar con varias técnicas conocidas, tales como la separación de la muestra en un gel con una transferencia posterior e exploración. Esto sólo puede realizarse después de que haya terminado la amplificación.

En un procedimiento homogéneo, la amplificación y la detección se producen sin separar los componentes de la reacción. Los amplicones se detectan durante la amplificación. Por lo tanto, la generación de amplicones se puede controlar en tiempo real y los datos así obtenidos se pueden utilizar para determinar la presencia o ausencia, o la cantidad del amplicón. Un tipo de sonda que es muy útil en tales técnicas homogéneas es la sonda fluorescible.

Las sondas fluorescibles son oligonucleótidos monocatenarios que tienen una estructura de horquilla. La porción del bucle contiene la secuencia complementaria al ácido nucleico diana (ADN o ARN) . El vástago se forma por la hibridación de la secuencia complementaria del extremo 3' con el extremo 5'. El vástago puede no estar relacionado con la diana y es bicatenario. Un brazo del vástago está marcado con un colorante fluorescente (fluoróforo) , mientras que el otro está acoplado a una molécula extintora de la fluorescencia. En el estado de horquilla, la sonda no produce fluorescencia porque la energía del fluoróforo se transfiere a la molécula extintora de la fluorescencia. Cuando la sonda fluorescible se hibrida con la diana, se pierde la estructura de horquilla y el extintor y el fluoróforo se separan. En esta fase la fluorescencia emitida por el fluoróforo se puede detectar y cuantificar. Recientemente el solicitante ha observado durante el desarrollo de ensayos utilizando MBs (del inglés “molecular beacon”, sonda fluorescible) para la detección de la diana, que la calidad de las enzimas disponibles comercialmente (por ejemplo, polimerasa de ARN de T7 (T7) ) que se utilizan normalmente, durante el proceso de amplificación difiere. Esto llevó a la observación de que diferentes lotes de T7, incluso del mismo proveedor, con la misma actividad específica y actividad de volumen, tenían diferentes niveles de abertura no deseada de las MBs (efecto IBL) , si estas MBs consisten en desoxirribonucleótidos naturales. Por lo tanto, aparece una señal fluorescente incluso en ausencia de secuencias dirigidas a la diana de forma específica, en la muestra biológica que se va a someter a ensayo, generando un posible resultado de falso positivo.

Si personas cualificadas podrían haber relacionado el efecto IBL con la propia T7, nuestras investigaciones mostraron inesperadamente que no es la propia T7 la que genera este fenómeno, sino que es más probable que sea al menos un contaminante desconocido en la T7, que puede variar de lote a lote. De acuerdo con las publicaciones expuestas en relación con el método para reducir el efecto de las variaciones en la secuencia en ensayos de hibridación de diagnóstico, el experto en la técnica podría haber determinado la utilidad de una MB que consiste sólo

en derivados de 2'-O-metilo para superar el efecto del IBL. El solicitante observó inesperadamente, que es mucho más eficaz introducir menos grupos 2'-O-metilo en la MB, y que la sustitución de todos los desoxirribonucleótidos naturales conduce a MBs no funcionales o menos funcionales.

En cuanto al efecto de las variaciones en la secuencia en ensayos de hibridación de diagnóstico, los amplicones generados en la reacción de amplificación se pueden detectar cuantitativa o cualitativamente. En el primer caso, se cuantifica la cantidad de amplicones generados. En un ensayo cualitativo solo se determina la presencia o ausencia de la sustancia a analizar.

Las variaciones en la secuencia (polimorfismos) de la sustancia a analizar pueden conducir a una hipocuantificación de la misma. También en el caso de ensayos cualitativos, las variaciones de la secuencia pueden dar como resultado falsos negativos. En general se supone que esto está causado por desemparejamientos entre la sustancia a analizar y los cebadores utilizados para amplificar la sustancia a analizar o por la estructura de la sustancia a analizar, que hace que los cebadores no se unan.

Se sabe que existen diversas cepas patógenas polimórficas de virus, como por ejemplo para las sustancias a analizar VIH, CMV, HSV, etc. Estas cepas polimórficas difieren entre sí por lo general en uno o varios nucleótidos. Cuando un cebador difiere de la sustancia a analizar, no se empareja muy bien lo que lleva a una amplificación reducida. Cuando la sustancia a analizar no es lineal sino que tiene una estructura particular, es menos accesible para el cebador, lo que a su vez conduce también a una amplificación reducida.

Además, las diferencias en la secuencia entre la secuencia diana amplificada de la sustancia a analizar y la sonda utilizada para la detección, disminuyen adicionalmente la eficacia de la detección. Las sustancias a analizar con polimorfismos se detectan por tanto peor que las sustancias a analizar que se emparejan perfectamente con la secuencia de consenso de la sonda. Sin embargo, la detección se realiza generalmente a temperaturas más bajas que la amplificación, y por lo tanto el efecto negativo de los desemparejamientos entre la sonda y la diana se espera que sea mucho menor que el que está causado por diferencias entre el cebador y la sustancia a analizar.

La sonda se puede mejorar para que se corresponda con polimorfismos conocidos. Sin embargo, en el caso de polimorfismos desconocidos esto no es posible. Esto es particularmente un problema, ya que los polimorfismos nuevos y desconocidos se generan continuamente, lo que dificulta una detección o cuantificación fiable especialmente en el caso del VIH.

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1. Sonda fluorescible, en donde el vástago de la sonda comprende:

• uno o vario.

2. O-metil-nucleótidos, y

• uno o varios nucleótidos no modificados.

2. Sonda fluorescible de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el bucle de la sonda comprende:

• uno o varios nucleótidos y/o análogos de nucleótidos que tienen una modificación que incrementa la afinidad seleccionados a partir de nucleótido.

2. O-derivatizados y ácidos nucleicos bloqueados, y

• uno o varios nucleótidos no modificados.

3. Sonda fluorescible de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el nucleótid.

2. O-derivatizado es u.

2. Ometil-nucleótido.

4. Sonda fluorescible de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde cada par de bases que constituyen el vástago no contienen más de u.

2. O-metil-nucleótido.

5. Sonda fluorescible de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde al menos un par de bases que constituyen el vástago no contien.

2. O-metil-nucleótido.

6. Sonda fluorescible de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde un par de bases que constituye el vástago no contien.

2. O-metil-nucleótido.

7. Sonda fluorescible de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde cada hebra que constituye el vástago contiene al menos u.

2. O-metil-nucleótido.

8. Uso de una sonda fluorescible de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en un ensayo de hibridación de diagnóstico.

9. Ensayo de hibridación de diagnóstico, que comprende las etapas de poner en contacto una serie de cebadores y una muestra que contiene la sustancia a analizar de ácido nucleico, para amplificar la sustancia a analizar y detectar la sustancia a analizar amplificada o su complemento, por medio de una sonda fluorescible, caracterizado porque la sonda fluorescible es una sonda de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

10. Ensayo de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el ensayo de diagnóstico es para determinar la cantidad de sustancia a analizar en la muestra.

11. Ensayo de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde el ensayo de diagnóstico es para determinar la presencia de la sustancia a analizar en la muestra.

12. Ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde el ensayo de diagnóstico es un ensayo homogéneo.

13. Ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde el ensayo de diagnóstico es un ensayo heterogéneo.

14. Kit para realizar un ensayo de amplificación de diagnóstico, que comprende los cebadores, polimerasa (s) y reactivos adecuados para realizar la amplificación de una sustancia a analizar que se va a diagnosticar y una sonda fluorescible de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.