Método de ensayo para la enfermedad de alzheimer.

Un método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer preclínica o clínica que comprende:

(a) medir el nivel de Aß42 en una muestra de sangre de un individuo obtenida al cabo de un intervalode tiempo después de administrar a dicho individuo una cantidad de un anticuerpo que se fijaespecíficamente a un epítope contenido en las posiciones 13-28 de Aß o un anticuerpo que secuestrael péptido Aß de su forma combinada circulante en la sangre y altera el aclaramiento de las formassoluble y combinada de Aß en el sistema nervioso central en plasma, en donde dicha cantidad eseficaz para alterar los niveles de péptidos Aß circulantes en la sangre de dicho individuo cuando dichoindividuo se encuentra en una fase preclínica o clínica de la enfermedad de Alzheimer; y

(b) comparar el nivel de Aß42 en dicho individuo con un valor de control de dichos niveles, en dondelos niveles elevados de Aß42 en dicho individuo comparados con niveles de control identifican quedicho individuo se encuentra en una etapa preclínica o clínica de la enfermedad de Alzheimer;en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende:

(i) una cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs)siguientes: CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1; CDR2 decadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; y CDR3 de cadena ligera quetiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3; y

(ii) una cadena pesada que comprende las CDRs siguientes: CDR1 de cadena pesada que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4; CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO. 5; y CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQID NO.6.

Método de ensayo para la enfermedad de Alzheimer

Campo Técnico

La invención se refiere a un ensayo que permite la diagnosis de la enfermedad de Alzheimer preclínica y clínica. El 5 test está basado en la evaluación de los niveles del péptido amiloide beta (Aº) en plasma después de la administración de ciertos anticuerpos anti-Aº a un individuo.

Técnica Anterior

Cierto número de sintomatologías que dan como resultado déficits cognitivos, accidente cerebrovascular, hemorragia cerebral, y debilitación mental general parecen estar asociadas con placas neuríticas y 10 cerebrovasculares en el cerebro que contienen el péptido amiloide beta (Aº) . Entre estas afecciones se encuentran tanto la enfermedad de Alzheimer preclínica como la clínica, el síndrome de Down y la angiopatía amiloide cerebral preclínica y clínica (CAA) . Las placas amiloides están formadas por péptidos de amiloide beta. Estos péptidos circulan en la sangre y en el fluido cerebroespinal (CSF) . El péptido Aº en forma circulante está compuesto de 39-43 aminoácidos (en la mayoría de los casos 40 ó 42 aminoácidos) resultantes de la escisión de una proteína precursora

común, la proteína precursora de amiloide, designada a menudo APP.

La evidencia sugiere que Aº puede transportarse alternativamente hacia atrás y adelante entre el cerebro y la sangre (Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883; Zlokovic, B.V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040; Shibata, M., et al., J. Clin. Invest. (2000) 106:1489-1499. Adicionalmente, Aº está en equilibrio en las placas con Aº soluble en el cerebro y la sangre (Kawarabayashi, T., et al., J. Neurosci. (2001)

21:372-381) , DeMattos et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci USA (2001) 98:8850-8855.

Como se describe en la solicitud PCT US00/35681 y U.S. Núm. de Serie 09/153130 incorporadas ambas en esta memoria por referencia, los niveles totales circulantes de péptido Aº en CSF son similares en los individuos normales y los individuos predispuestos para exhibir los síntomas del Alzheimer. Sin embargo, los niveles de Aº42 son más bajos por término medio en los individuos que padecen la enfermedad de Alzheimer (Nitsch, RM., et al.,

Ann. Neurol. (1995) 37:512-518) . Es sabido que Aº42 es más propenso a agregarse que lo es Aº42, y cuando sucede esto, sobrevienen consecuencias adversas tales como la deposición de Aº en placas amiloides, conversión de Aº en formas tóxicas, deterioro de células nerviosas, y empeoramiento conductual tal como demencia (Golde T.E., et al., Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502:172-187) .

La solicitud PCR PCT/US01/06191 titulada "Humanized Antibodies That Sequester Aº Peptide", presentada el 26 de

febrero de 2001 e incorporada en esta memoria por referencia, describe anticuerpos que no atraviesan apreciablemente la barrera hematoencefálica y que secuestran los péptidos Aº que circulan en los fluidos biológicos. Estos anticuerpos se describen como útiles para tratamiento preventivo y terapéutico de afecciones asociadas con la formación de placas difusas, neuríticas y cerebrovasculares que contienen Aº en el cerebro. La solicitud describe la administración de los anticuerpos seguida por la medición de los niveles circulantes del péptido Aº en la sangre a fin

de evaluar el progreso de la terapia. No se hace sugestión clara alguna, sin embargo, de que los niveles de péptido Aº después de la administración de los anticuerpos sean diagnósticos de la afección propiamente dicha. La presente invención está basada en el resultado sorprendente de que niveles incrementados tanto de Aº40 como de Aº42, así como la ratio Aº40/Aº42 están correlacionados con los niveles de deposición del péptido Aº en el cerebro cuando los anticuerpos se han administrado a un individuo. Así pues, la medida de estos componentes en la sangre

después de administración del anticuerpo proporciona un test de diagnóstico directo para la enfermedad de Alzheimer tanto clínica como preclínica y trastornos neurológicos afines.

Existen publicaciones relevantes adicionales concernientes al comportamiento de los anticuerpos del péptido Aº. Por ejemplo, la publicación PCT WO 99/27944 publicada el 10 de junio de 1999 describe métodos para inducir una respuesta inmune a fin de reducir los depósitos amiloides. La publicación No. WO 99/60024 publicada el 25 de

45 noviembre de 1999 describe métodos para eliminación del amiloide utilizando anticuerpos anti-amiloide. Publicaciones PCT adicionales, que incluyen WO 00/72880, WO 00/72876 y WO 00/77178 describen todas ellas diversas actividades de anticuerpos anti-péptido Aº. Se dice que los anticuerpos dirigidos al término N de este péptido reducen las placas en un modelo de murino transgénico; se describe la inmunización con el amiloide propiamente dicho, así como anticuerpos diseñados para catalizar la hidrólisis del péptido.

50 Se ha demostrado que un camino para el metabolismo de Aº es por transporte desde el CNS al plasma (Zlokovic, B.V., et al., Proc. Natl. Acad Sci (USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67: 880-883) . Adicionalmente, se ha demostrado que Aº en el plasma puede atravesar la barrera hematoencefálica y entrar en el cerebro (Zlokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040) . Se ha demostrado también que la administración de ciertos anticuerpos Aº policlonales y monoclonales reduce la deposición de Aº en

55 placas amiloides en el modelo de ratón transgénico APPV717F de la enfermedad de Alzheimer (Bard, F., et al., Nature Med. (2000) 6:916-919) . Se dijo que esto era debido a que ciertos anticuerpos anti-Aº atraviesan la barrera hematoencefálica y estimulan la fagocitosis de las placas amiloides por las células microgliales. En los experimentos de Bard, ensayos de cortes de cerebro ex vivo demostraron que la presencia de anticuerpo A añadido, junto con microglía añadida exógenamente, inducía la fagocitosis de A , dando como resultado la eliminación de los depósitos de A .

Los niveles de A 40 y A 42, ambos solubles, en CSF y sangre pueden ser detectados fácilmente utilizando ensayos

estandarizados que utilizan anticuerpos dirigidos contra los epítopes a lo largo de la cadena de A . Tales ensayos han sido consignados, por ejemplo, en las Patentes U.S. 5.766.846; 5.837.672; y 5.593.846. Estas Patentes describen la producción de anticuerpos monoclonales murinos para el dominio central del péptido A , y se consignó que éstos tienen epítopes alrededor de las posiciones 16 y 17, ambas inclusive. Se describían también anticuerpos dirigidos contra la región N-terminal. Se afirmaba que varios anticuerpos monoclonales inmunorreaccionan con las

posiciones 13-28 del péptido A ; éstos no se fijaban a un péptido que representa las posiciones 17-28, estableciendo por tanto, de acuerdo con las citadas Patentes, que es esta región, con inclusión de las posiciones 1617 (el sitio de la secretasa 0) la que constituía la diana de estos anticuerpos. Entre los anticuerpos conocidos que se fijan entre los aminoácidos 13 y 28 de A se encuentran los anticuerpos de ratón 266 (m266) , 4G8 y 1C2.

Exposición de la Invención

Se ha encontrado ahora que anticuerpos que son útiles para realización de ensayos para el péptido A , y que son útiles en el tratamiento de afecciones asociadas con las placas amiloides en el cerebro, pueden provocar una respuesta que da como resultado un aumento acusado en el nivel de péptido A en la sangre, y este nivel puede utilizarse como marcador de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer clínica y preclínica. Estos anticuerpos, que pueden ser o no anticuerpos humanizados, secuestran el péptido A de su forma combinada circulante en la

sangre, y alteran el aclaramiento de las formas soluble y combinada de A en el sistema nervioso central y el plasma. Estos anticuerpos, y fragmentos de los mismos, se fijan específicamente a un epítope entre los aminoácidos 13 y 28 de la molécula A . La CDR de estos anticuerpos puede derivarse del anticuerpo monoclonal de ratón 266 (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6) . Anticuerpos útiles incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, en donde las regiones variables tienen secuencias que comprenden la CDR del anticuerpo de ratón 266 y secuencias de

entramado humanas específicas (SEQ... [Seguir leyendo]

1. Un método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer preclínica o clínica que comprende:

(a) medir el nivel de A 42 en una muestra de sangre de un individuo obtenida al cabo de un intervalo de tiempo después de administrar a dicho individuo una cantidad de un anticuerpo que se fija

específicamente a un epítope contenido en las posiciones 13-28 de A o un anticuerpo que secuestra el péptido A de su forma combinada circulante en la sangre y altera el aclaramiento de las formas soluble y combinada de A en el sistema nervioso central en plasma, en donde dicha cantidad es eficaz para alterar los niveles de péptidos A circulantes en la sangre de dicho individuo cuando dicho individuo se encuentra en una fase preclínica o clínica de la enfermedad de Alzheimer; y

(b) comparar el nivel de A 42 en dicho individuo con un valor de control de dichos niveles, en donde los niveles elevados de A 42 en dicho individuo comparados con niveles de control identifican que dicho individuo se encuentra en una etapa preclínica o clínica de la enfermedad de Alzheimer;

en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende:

(i) una cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs)

siguientes: CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1; CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2; y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3; y

(ii) una cadena pesada que comprende las CDRs siguientes: CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4; CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de

aminoácidos SEQ ID NO. 5; y CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.6.

2. El método de la reivindicación 1, en el cual dicho intervalo de tiempo es menor que 1 semana.

3. El método de la reivindicación 1, en el cual dicho intervalo de tiempo es menor que o igual a 24 horas.

4. El método de la reivindicación 3, en el cual el intervalo de tiempo es menor que o igual a 3 horas.

5. El método de la reivindicación 1, en el cual dicha administración se realizó por inyección de dichos anticuerpos.

6. El método de la reivindicación 1, en el cual el individuo es humano y el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.

7. El método de la reivindicación 6, en el cual el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende una 30 cadena ligera de SEQ ID NO: 11 y una cadena pesada SEQ ID NO: 12.

8. El método de la reivindicación 6, en el cual el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende una cadena ligera de SEQ ID NO: 11 y una cadena pesada SEQ ID NO: 16.

9. El método de la reivindicación 6, en el cual el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende una

cadena ligera que comprende una región variable de SEQ ID NO: 7 y una cadena pesada que comprende una 35 región variable de SEQ ID NO: 14.

10. El método de la reivindicación 1, en el cual dicho anticuerpo es un fragmento.

11. El método de la reivindicación 1, en el cual el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.

LEs significativa a corre ación? (a fa=0 05)

Si

R cuadrado

0 6380

Ve ocidades de AS40

Ve ocidades de AS40

(og AS oor m oor min)

(og AS oor m oor min)

Ratio de ve ocidades

Ve ocidad de Entrada de AS40 en P asma

% Deoosición AS

Ve ocidad de Entrada de AS42 en P asma

% Deoosición AS

Ratio de ve ocidades de Entrada AS401 AS42 en P asma

% Deoosición AS

Figura 4