MÉTODO DE DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA DE SECUENCIAS DIANA DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Método de detección electroquímica de secuencias diana de ácidos nucleicos,

siendo dicho método del tipo según el cual: - se prepara una muestra biológica que puede incluir al menos un ácido nucleico, pudiendo dicho ácido nucleico contener una secuencia diana determinada; - se prepara un agente oxidante capaz de oxidar al menos una base nucleotídica de dicha secuencia diana determinada; - se preparan medios complementarios que se pueden acoplar con dicha secuencia diana determinada, incluyendo dichos medios complementarios medios de amplificación activables adaptados para replicar dicha secuencia diana cuando la muestra biológica se mezcla con dichos medios de amplificación activables, comprendiendo los medios de amplificación al menos dos nucleótidos de un tipo que incluye dicha base nucleotídica, siendo aptos los nucleótidos del dicho tipo para ser consumidos durante la replicación para formar ácidos nucleicos replicados; - se mezcla el agente oxidante con la muestra biológica; - se aplica un campo eléctrico a dicha muestra, estando adaptado este campo eléctrico para provocar una reacción del agente oxidante con la base nucleotídica; y se mide la corriente eléctrica que atraviesa la muestra para determinar la presencia de dicha secuencia diana cuando la corriente eléctrica disminuye; caracterizado porque comprende, por orden, las siguientes etapas: a) la muestra biológica y el agente oxidante se mezclan con los medios de amplificación activables; b) se activan los medios de amplificación activables; y c) la muestra biológica se somete a un campo eléctrico durante la amplificación para medir la corriente resultante de ello, con el fin de determinar la presencia de dicha secuencia diana determinada cuando la corriente eléctrica disminuye.

La presente invención se refiere a un método de detección electroquímica de secuencias diana de ácidos nucleicos y a una unidad de detección para la puesta en práctica de dicho método.

Son conocidos métodos que, mediante detección electroquímica, permiten identificar la presencia o no de una secuencia diana de un ácido nucleico en una muestra biológica determinada.

Estos métodos permiten en particular detectar en un ácido nucleico una secuencia diana que corresponde por ejemplo a una parte del patrimonio genético de un virus dado.

De acuerdo con las técnicas conocidas, una vez identificada esta secuencia de nucleótidos se generan sondas formadas por oligonucleótidos que incorporan dicha secuencia y después estas sondas se fijan sobre un soporte sólido. Las sondas incluyen un número determinado de nucleótidos que presentan una base nucleotídica oxidable. A continuación, la muestra biológica determinada se pone en contacto con el soporte sólido en el que están fijadas dichas sondas, para que, llegado el caso, se produzca la hibridación del ácido nucleico que contiene la secuencia diana con la sonda. Después, el ácido nucleico hibridado se somete a reacción con un complejo de un metal de transición capaz de oxidar las bases de los nucleótidos de la sonda de oligonucleótidos; y se determina la presencia o no de esta hibridación, que se produce si la muestra biológica comprende un ácido nucleico que incluye dicha secuencia diana, aplicando un campo eléctrico variable a la muestra y midiendo paralelamente la corriente eléctrica que circula por la misma. En este contexto, la corriente eléctrica depende del número de bases dadas susceptibles de oxidación. En efecto, cuando se realiza un barrido de potencial y paralelamente se registra la corriente eléctrica que circula por la muestra, la respuesta a la corriente eléctrica es diferente cuando la sonda está hibridada con el ácido nucleico que incluye la secuencia diana a cuando no lo está. En cualquier caso, la corriente eléctrica de oxidación de la base de los nucleótidos de la sonda hibridada tiene un valor más alto que el asociado a la oxidación de la base de los nucleótidos no hibridados.

**(Ver fórmula)**

Véase en particular el documento US 2002/106.683, que describe un procedimiento de detección de este tipo.

Sin embargo, la puesta en práctica de un método de este tipo es relativamente compleja, en particular porque es necesario preparar sondas de oligonucleótidos para fijarlas sobre el soporte sólido, siendo este proceso largo y costoso.

Véase también el documento EP-A-1 500 933, que da a conocer la puesta en práctica, en una primera etapa, de un método de amplificación de la secuencia diana eventualmente presente en la muestra biológica y a continuación, en una segunda etapa, un método de detección electroquímica.

Por consiguiente, un problema que se plantea y que la presente invención pretende resolver consiste en proporcionar un método que no sólo sea más fácil de poner en práctica, sino que también resulte más económico.

Con el fin de resolver este problema, y según un primer aspecto, la presente invención propone un método de detección electroquímica de secuencias diana de ácido nucleico, siendo dicho método del tipo según el cual: se prepara una muestra biológica que puede incluir al menos un ácido nucleico, pudiendo dicho ácido nucleico contener una secuencia diana determinada, mezclándose dicha muestra biológica con un agente oxidante e incluyendo dicha secuencia diana una base nucleotídica que puede ser oxidada por dicho agente oxidante; se preparan medios complementarios que se pueden acoplar con dicha secuencia diana determinada; se aplica un campo eléctrico a dicha muestra, estando adaptado dicho campo eléctrico para provocar una reacción de dicho agente oxidante con dicha base nucleotídica, y se mide la corriente eléctrica que atraviesa la muestra para determinar la presencia de dicha secuencia diana. De acuerdo con la invención, dichos medios complementarios incluyen medios de amplificación activables adaptados para replicar dicha secuencia diana, comprendiendo los medios de amplificación al menos nucleótidos de un tipo que incluye dicha base nucleotídica, pudiendo los nucleótidos de este tipo ser consumidos durante la replicación para formar ácidos nucleicos replicados; y, si la corriente eléctrica disminuye cuando los medios de amplificación están activados, se determina la presencia de dicha secuencia diana.

**(Ver fórmula)**

Por consiguiente, una característica de la invención consiste en la puesta en práctica de un método de amplificación de un ácido nucleico y la medición simultánea de una corriente eléctrica, demostrando la medida de esta corriente eléctrica si se ha consumido o no uno de los elementos de los medios de amplificación durante la misma, y concretamente uno de los nucleótidos libres. Si la secuencia diana de ácido nucleico se corresponde con los medios de amplificación activables, esta secuencia diana se replicará durante el proceso de amplificación y el número de nucleótidos libres utilizados como sustrato durante esta replicación, y cuya concentración se determina al principio, disminuirá. En consecuencia, si el número de nucleótidos libres disminuye en beneficio del número de nucleótidos incorporados en los ácidos nucleicos sintetizados durante la amplificación, el agente oxidante sólo podrá reaccionar con una cantidad cada vez más limitada de bases nucleotídicas, correspondientes a los nucleótidos libres, y, por consiguiente, se producirán menos transferencias electrónicas y la corriente eléctrica medida en último término disminuirá. En la descripción detallada dada más abajo se explicará no obstante más en detalle que el agente oxidante también puede oxidar las bases de los nucleótidos incorporados en el ácido nucleico inicialmente presente y en los ácidos nucleicos sintetizados por replicación, pero que, en cambio, la corriente eléctrica resultante de ello se reduce en relación con la que resulta de la oxidación de las bases de los nucleótidos libres.

Según una forma de realización particularmente ventajosa de la invención, el ácido nucleico en el que se procura identificar una secuencia diana es una molécula de ADN o de ARN simple o bicatenaria. Además, los medios de amplificación activables comprenden medios adaptados para posterior hibridación aguas arriba de una secuencia diana y medios para proceder a su replicación. El número de ácidos nucleicos resultante de esta replicación crece exponencialmente con el tiempo, de modo que el número de nucleótidos libres que presentan la base nucleotídica oxidable disminuye también exponencialmente con el tiempo y paralelamente la disminución de la corriente que atraviesa la muestra es rápidamente perceptible.

Ventajosamente, la base nitrogenada asociada a los nucleótidos libres es una base nucleotídica de purina, por ejemplo guanina o un análogo químico de la guanina, por ejemplo de tipo mercaptoguanina u oxoguanina, y el agente oxidante utilizado es un complejo de rutenio. Éste presenta una forma reducida y una forma oxidada, catalizando ésta última de forma irreversible la oxidación de la guanina. Cuando se aplica el campo eléctrico a la mezcla, la corriente medida resultante depende esencialmente de la concentración de nucleótidos libres que presentan el residuo guanina, ya que, aunque el agente oxidante también oxida la guanina de los nucleótidos incorporados en el ácido nucleico replicado, tanto la cinética de oxidación como el coeficiente de difusión de los nucleótidos libres son muy superiores a los de dichos ácidos nucleicos replicados.

**(Ver fórmula)**

Además, dado que el número de ácidos nucleicos resultante de la replicación de dichas secuencias diana depende del tiempo, la disminución de la corriente que atraviesa la muestra también depende del tiempo. Por consiguiente, si la muestra inicial presenta una alta concentración de ácido nucleico y todos estos ácidos nucleicos del mismo tipo presentan la secuencia diana, el consumo de nucleótidos será correspondientemente alto. La medida de la variación de corriente eléctrica también se percibirá correspondientemente con mayor rapidez. En cambio, si la concentración de ácido nucleico es menor, se requerirá más tiempo para observar la variación de la corriente. Por ello, esta invención es aplicable para una determinación cuantitativa de la secuencia diana.

Así, en la práctica se aplicará un campo eléctrico y se medirá la corriente... [Seguir leyendo]

1. Método de detección electroquímica de secuencias diana de ácidos nucleicos, siendo dicho método del tipo según el cual:

 se prepara una muestra biológica que puede incluir al menos un ácido nucleico, pudiendo dicho ácido nucleico contener una secuencia diana determinada;

 se prepara un agente oxidante capaz de oxidar al menos una base nucleotídica de dicha secuencia diana determinada;

 se preparan medios complementarios que se pueden acoplar con dicha secuencia diana determinada, incluyendo dichos medios complementarios medios de amplificación activables adaptados para replicar dicha secuencia diana cuando la muestra biológica se mezcla con dichos medios de amplificación activables, comprendiendo los medios de amplificación al menos dos nucleótidos de un tipo que incluye dicha base nucleotídica, siendo aptos los nucleótidos del dicho tipo para ser consumidos durante la replicación para formar ácidos nucleicos replicados;

 se mezcla el agente oxidante con la muestra biológica;

 se aplica un campo eléctrico a dicha muestra, estando adaptado este campo eléctrico para provocar una reacción del agente oxidante con la base nucleotídica; y se mide la corriente eléctrica que atraviesa la muestra para determinar la presencia de dicha secuencia diana cuando la corriente eléctrica disminuye;

caracterizado porque comprende, por orden, las siguientes etapas:

a) la muestra biológica y el agente oxidante se mezclan con los medios de amplificación activables;

b) se activan los medios de amplificación activables; y

c) la muestra biológica se somete a un campo eléctrico durante la amplificación para medir la corriente resultante de ello, con el fin de determinar la presencia de dicha secuencia diana determinada cuando la corriente eléctrica disminuye.

**(Ver fórmula)**

2. Método de detección según la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es una molécula de ADN o ARN.

3. Método de detección según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicha base nucleotídica es una base nitrogenada de purina.

4. Método de detección según la reivindicación 3, caracterizado porque la base nucleotídica consiste en guanina o un análogo químico de la guanina.

5. Método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el agente oxidante es un complejo de rutenio.

6. Método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, dado que las secuencias diana se replican con el paso del tiempo, la corriente eléctrica se mide después de haber aplicado el campo eléctrico durante un tiempo determinado.

7. Método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la secuencia diana se replica de acuerdo con ciclos de amplificación, y porque dicha corriente se mide después de un número determinado de ciclos.

8. Método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicho campo eléctrico se aplica entre electrodos aptos para ser sumergidos en la muestra.

9. Método de detección según la reivindicación 8, caracterizado porque uno de dichos electrodos es un electrodo basado en óxidos metálicos.

10. Método de detección según la reivindicación 8, caracterizado porque uno de dichos electrodos es un electrodo basado en un metal noble.

11. Método de detección según la reivindicación 8, caracterizado porque uno de dichos electrodos es un electrodo de carbono.

12. Método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque el agente oxidante está situado junto a la superficie de uno de los electrodos.

13. Método de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque incluye además las siguientes etapas:

**(Ver fórmula)**

 se suministra adicionalmente un compuesto redox capaz de reaccionar a un valor de campo eléctrico desplazado diferente del valor de campo eléctrico al que reaccionan dicho agente oxidante y dicha base nucleotídica;

 se mide el valor de la corriente eléctrica redox en dicho valor de campo eléctrico desplazado; y

 se determina la presencia de dicha secuencia diana determinada cuando la diferencia de corriente eléctrica entre la corriente eléctrica redox y la corriente eléctrica de reacción del agente oxidante y de la base nucleotídica disminuye al activarse los medios de amplificación.

14. Unidad de detección electroquímica de secuencias diana de ácidos nucleicos, que comprende:

 medios (30, 44, 94) para recibir una muestra biológica (34, 95) que puede incluir al menos un ácido nucleico, pudiendo dicho ácido nucleico contener una secuencia diana determinada, estando mezclada dicha muestra biológica con un agente oxidante, incluyendo dicha secuencia diana al menos una base nucleotídica apta para ser oxidada por dicho agente oxidante;

 medios complementarios que se pueden acoplar con dicha secuencia diana determinada;

 medios (38, 42, 52, 54, 96) para aplicar un campo eléctrico a dicha muestra, estando adaptado este campo eléctrico para provocar una reacción del agente oxidante con la base nucleotídica; y medios de medición (42, P) de una corriente eléctrica que atraviesa dicha muestra para determinar la presencia de dicha secuencia diana;

caracterizada porque los medios complementarios comprenden medios de amplificación activables adaptados para replicar la secuencia diana, comprendiendo dichos medios de amplificación al menos nucleótidos de un tipo que incluye dicha base nucleotídica, siendo los nucleótidos de este tipo aptos para ser consumidos durante la replicación para formar ácidos nucleicos replicados; y porque los medios de medición (42, P)

**(Ver fórmula)**

5 proporcionan un valor decreciente de corriente eléctrica cuando se activan los medios de amplificación en caso de que el ácido nucleico contenga la secuencia diana determinada.