Ligando de HTK.

SE DESCRIBE UN NUEVO LIGANDO RECEPTOR DE CINASA DE TRANSMEMBRANA DE HEPATOMA (LIGANDO HTK) EL CUAL SE UNE,

Y ACTIVA, EL RECEPTOR HTK. COMO EJEMPLOS, SE HAN IDENTIFICADO LIGANDOS HTK DE RATON Y DE HUMANO EN UNA VARIEDAD DE TEJIDOS MEDIANTE UNA PROTEINA SOLUBLE DE FUSION HTK-FC. LOS LIGANDOS HAN SIDO CLONADOS Y SECUENCIADOS. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN EL LIGANDO, METODOS DE PRODUCCION Y USO DEL LIGANDO, Y ANTICUERPOS DIRIGIDOS AL MISMO.

Ligando de HTK

Antecedentes de la invención Campo de la invención [0001] La presente invención hace referencia en general a un ligando del receptor de proteína tirosina quinasa (rPTK) . En particular, la invención hace referencia a un nuevo ligando que se une a, y activa, el receptor quinasa transmembrana de hepatoma (Htk) (también conocido como el receptor HpTK 5) y al aislamiento y producción recombinante del mismo.

Descripción de la técnica relacionada [0002] La transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está controlada en parte por la fosforilación de diversas proteínas celulares. Las proteínas tirosina quinasas son enzimas que catalizan este proceso. Los miembros de la familia de proteínas tirosina quinasas pueden ser reconocidos por la presencia de algunas regiones aminoacídicas conservadas en el dominio catalítico de tirosina quinasa (Hanks y col., Science 241:42-52 [1988]) . El dominio de tirosina quinasa está implicado en las vías de transducción de señales de la mitogénesis, la transformación y la diferenciación celular. Ciertas tirosinas quinasas estimulan predominantemente el crecimiento y la diferenciación celular, mientras que otras tirosina quinasas detienen el crecimiento celular y promueven la diferenciación. Además, dependiendo del entorno celular en el que se expresan, la misma tirosina quinasa puede estimular, o inhibir, la proliferación celular. Véase Schlessinger y col., Neuron 9:383-391 [1992].

Los receptores de proteína tirosina quinasa (rPTKs) transmiten las señales extracelulares a las vías de señalización intracelular y en consecuencia controlan la proliferación y diferenciación celular. Estos rPTKs comparten una estructura similar, con una parte catalítica intracelular, un dominio transmembrana y un dominio de unión al ligando extracelular. (Schlessinger y col., supra) . Los dominios extracelulares (ECDs) , que son responsables de la unión al ligando y de la transmisión de señales biológicas, han mostrado estar compuestos de diversos motivos estructurales distintos. El dominio intracelular comprende una proteína catalítica tirosina quinasa.

Los receptores tirosina quinasa se dividen en diversas clases, de acuerdo con su secuencia y similitudes estructurales. Por ejemplo, los receptores de Clase V tienen regiones ricas en cisteína y fibronectina de Tipo III en el dominio extracelular e incluyen los receptores EPH, ELK, ERK, EEK, ECK y HEK. Para una revisión de las diversas clases de receptores tirosina quinasas y sus funciones, véase, por ejemplo, Hanks y col., supra y Schlessinger y col., supra.

Los ligandos proteicos para los receptores de proteína tirosina quinasa se unen al dominio extracelular de sus receptores dobletes en la superficie celular y de este modo estimulan la fosforilación de tirosinas. Algunos de estos ligandos son factores de crecimiento o citoquinas, tales como el factor de crecimiento 1 de tipo insulina (IGF-1) , el factor de crecimiento epitelial (EGF) , el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el factor de crecimiento nervioso (NGF) . Los ligandos para diversos receptores tirosina quinasa han demostrado que funcionan en el sistema hematopoyético. Por ejemplo, el ligando para el receptor tirosina quinasa flt3/flk-2 murino, clonado recientemente, estimula la proliferación de células hematopoyéticas primitivas de ratón y las de médula ósea CD-34 positivas humanas. Lyman y col., Cell 75:1157-1167 (1993) .

Un ligando proteico que estimula la fosforilación del receptor ECK se ha clonado recientemente y se ha expresado en células CHO. Bartley y col., Nature 368:558-560 (1994) . Este ligando de ECK se halló que era idéntico a B61, una molécula aislada con anterioridad por Holzman y col., Mol. Cell. Biol. 10:5830-5838 (1990) .

Recientemente, se ha identificado y clonado un receptor tirosina quinasa a partir de una línea de células de carcinoma hepatocelular humanas, Hep 3B. Este receptor, denominado receptor “Htk” o receptor “HpTK 5”, se cree que pertenece a la Clase V o a la subfamilia EPH o rPTKs. Véase Bennett y col., J. Biol. Chem., 269 (19) :1421114218 (1994) .

El análisis de transferencia de Northern de los tejidos fetales humanos demostró que la expresión del ácido nucleico del receptor de Htk tiene lugar en el corazón, pulmón, hígado, cerebro y riñón. En el tejido humano adulto, no se detectó ninguna señal en el cerebro, mientras que sí se observó una señal especialmente intensa en la placenta, seguido por el riñón, hígado, pulmón y páncreas. El músculo esquelético y el corazón presentaron una señal de menor intensidad. Véase Bennett y col., supra.

La expresión del ácido nucleico del receptor Htk en las líneas celulares de tumores humanos también se analizó por transferencia de Northern. Las líneas celulares derivadas del hígado, mama (MCF-7) , colon (Colo 205) , pulmón (NCI 69) , melanocitos (HM-1) y cérvix (HeLa) presentaron señales detectables de tamaño adecuado. Se observó la presencia de RNA mensajero en líneas celulares seleccionadas de origen hematopoyético. K562 (una célula mieloide primitiva multipotente) , THP-1 (una célula monocitoide) , U937 (una línea celular mielomonocítica) , Hep3B (una línea celular de hepatocarcinoma humano) , y CMK (de origen megacariocítico) fueron todas positivas para el RNA mensaje del receptor Htk, pero las células linfoides (H9, Jurkat, JH-1, Raji, Ramos) u otras células mieloides seleccionadas (KG-1-o KMT2) no presentaron un transcrito detectable por transferencia de Northern. Véase Bennett y col., supra.

El homólogo murino del receptor Htk, denominado “myk-1”, se aisló a partir del epitelio de glándulas mamarias. Véase Andres y col., Oncogene 9:1461-1467 (1994) . Andres y col., publicaron que myk-1 se induce durante la proliferación del epitelio de mamíferos y se inhibe durante su diferenciación. Además, la expresión no regulada del receptor se considera que representa potencialmente un suceso temprano en la carcinogénesis de la glándula mamaria (véase Andres y col., supra) .

Sin embargo, se cree que el ligando proteico para el receptor Htk no se ha descubierto todavía. En consecuencia, es un objetivo de la presente invención proporcionar un ligando para el receptor Htk.

Es otro objetivo de la invención proporcionar el ácido nucleico que codifica el ligando de Htk para que éste pueda generarse mediante tecnología de ADN recombinante.

Éstos y otros objetivos serán evidentes para un experto en la materia tras considerar la memoria globalmente.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCION

La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones 1-13.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LAS FIGURAS

Las Figuras 1A-1B muestran una alineación de la secuencia nucleotídica (SEC ID NO:1) y de la secuencia aminoacídica deducida (SEC ID NO:2) del ligando de Htk murino que se describe en la presente. La Figura 2 muestra una alineación de la secuencia nucleotídica (SEC ID NO:3) y de la secuencia aminoacídica (SEC ID NO:4) del ligando de Htk humano que se describe aquí. La Figura 3 muestra una alineación de las secuencias aminoacídicas del ligando de Htk murino (muHtkL) y del ligando de Htk humano (humHtkL) (SEC ID Nos:2 y 4, respectivamente) . Los residuos idénticos están encuadrados. El área sombreada representa un dominio transmembrana. El dominio extracelular y el intracelular son N-terminal y C-terminal al dominio transmembrana, respectivamente. El aminoácido predicho como sitio de corte para el péptido señal está indicado por una flecha. Los sitios de N-glicosilación están marcados con un (*) y las cisteínas conservadas están marcadas con un (T) . La Figura 4 muestra la secuencia nucleotídica (SEC ID NO:5) y la secuencia aminoacídica deducida (SEC ID NO:6) del receptor Htk humano descrito en Bennett y col., supra. El aminoácido predicho como sitio de corte para el péptido señal se indica con una flecha. Los residuos cisteína conservados entre los miembros de la familia ELK están marcados con un círculo y la región transmembrana está subrayada. Las Figuras 5A-5B muestran las curvas de competición por la unión de Htk-Fc con la línea celular SV40MES 13 (Figura 5A) o el ligando de Htk murino recombinante expresado en las células COS-7 (Figura 5B) . La representación de Scatchard de cada curva de unión se muestra en el interior de las figuras e indica las Kds de 3 nM y 0, 5 nM, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

... [Seguir leyendo]

1. Molécula proteica aislada que se une al receptor Htk y que induce la fosforilación del receptor Htk, comprendiendo la molécula la secuencia aminoacídica para el ligando de Htk murino maduro de SEC ID NO:2.

2. Ligando de Htk soluble aislado que se une al receptor Htk y comprende la secuencia aminoacídica para el ligando de Htk murino maduro soluble de aminoácido.

2. 227 de la SEC ID NO:2.

3. Composición que comprende la molécula proteica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Molécula de ácido nucléico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una molécula proteica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

5. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 4 que codifica la secuencia aminoacídica para el ligando de Htk murino maduro de la secuencia SEC ID NO:2.

6. Molécula de ácido nucléico aislada según la reivindicación 5 que presenta una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) residuos 242 a 1168, inclusives, de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada como SEC ID NO:1, y

(b) una secuencia correspondiente a la secuencia de (a) en el ámbito de degeneración del código genético.

7. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 4 que codifica la secuencia aminoacídica para el ligando de Htk murino maduro soluble de aminoácido.

2. 227 de la SEC ID NO:2.

8. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

9. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 8.

10. Procedimiento para la preparación de una molécula proteica que induce la fosforilación del receptor Htk que comprende el cultivo de una célula huésped transfectada para expresar la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9 y la recuperación de dicha molécula proteica del cultivo de la célula huésped.

11. Procedimiento para activar “in vitro” un dominio tirosina quinasa de un receptor de quinasa transmembrana de hepatoma (receptor Htk) que comprende poner en contacto un dominio extracelular del receptor Htk con el ligando de Htk según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

12. Anticuerpo monoclonal que se une a una molécula proteica aislada que se une al receptor Htk y que induce la fosforilación del receptor Htk, siendo la secuencia aminoacídica de la molécula proteica la secuencia aminoacídica para el ligando de Htk murino maduro de la SEC ID NO: 2 o la secuencia aminoacídica para el ligando de Htk humano maduro de la SEC ID NO: 4; o un ligando de Htk soluble aislado que se une al receptor Htk, siendo la secuencia aminoacídica del ligando de Htk soluble la secuencia aminoacídica para el ligando de Htk murino maduro soluble de aminoácidos 28227 de la SEC ID NO: 2 o el ligando de Htk humano maduro soluble de aminoácido.

2. 224 de la SEC ID No: 4;

en el que el anticuerpo monoclonal está marcado, opcionalmente con un isótopo radioactivo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano;

es un anticuerpo humanizado; es un anticuerpo humano; es una fusión de anticuerpo con una proteína heteróloga; es un fragmento de anticuerpo que se une a la molécula proteica que se une al receptor Htk, por ejemplo, Fab, F (ab’) 2 o Fv; es biespecífico; o es un anticuerpo heteroconjugado.

13. Procedimiento para la producción de un anticuerpo monoclonal que se une a una molécula proteica aislada que se une al receptor Htk y que induce la fosforilación del receptor Htk, siendo la secuencia aminoacídica de la molécula proteica la secuencia aminoacídica para el ligando de Htk murino maduro de la SEC ID NO: 2 o la secuencia aminoacídica para el ligando de Htk humano maduro de la SEC ID NO: 4; o un ligando de Htk soluble aislado que se une al receptor Htk, siendo la secuencia aminoacídica del ligando de Htk soluble la secuencia aminoacídica para el ligando de Htk murino maduro soluble de aminoácidos 28227 de la SEC ID NO: 2 o el ligando de Htk humano maduro soluble de aminoácido.

2. 224 de la SEC ID

No: 4; comprendiendo el procedimiento la producción del anticuerpos mediante un procedimiento de ADN recombinante, a partir de una librería de fagos o a partir de un ratón transgénico capaz tras la inmunización de la producción de anticuerpos humanos.