Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi.

Una composición que comprende un agente de ARNi que contiene una cadena sentido y una cadena antisentido,

en donde:

a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND8453 (SEQ ID NO:1425 ), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND8453 (SEQ m NO: 1426 ), o

b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND8489 (SEQ ID NO:1497), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND8489 (SEQ m NO: 1498); o

c . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND8456 (SEQ ID NO:1431), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos de la cadena antisentido de ND8456 (SEQ IDNO: 1432).

Campo tecnico La invencion se refiere al campo del transporte ionico a traves de las vias respiratorias mediado por ENaC, y a las composiciones y metodos para modular la expresion de alfa-ENaC, y mas particularmente, con la subregulacion de alfa-ENaC mediante oligonucleotidos por medio de la interferencia del ARN, que se administran localmente a los pulmones y al pasaje nasal por medio de administracion por inhalacion/intranasal, o se administran en forma sistemica, por ejemplo, mediante inyeccion intravenosa.

Antecedentes El ARN de interferencia, o quot;ARNiquot; es un termino inicialmente acunado por Fire y colaboradores para describir la observacion de que el ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresion genica cuando se introduce en gusanos (Fire et al., Nature 391: 806 - 811, 1998) . El ARNbc corto dirige el silenciamiento post-transcripcional

especifico del gen en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la funcion del gen. Esta tecnologia ha sido revisada numerosas veces recientemente; vease, por ejemplo, Novina, C. D., y Sharp, P., Nature 2004, 430: 161, y Sandy, P., y colaboradores, Biotechniques 2005, 39: 215.

Las superficies mucosas en la interfase entre el medio ambiente y el cuerpo, han desarrollado una cantidad de mecanismos de proteccion. Una forma principal de tal defensa innata, es limpiar estas superficies con liquido. 20 Tipicamente, la cantidad de la capa de liquido sobre una superficie mucosa refleja el equilibrio entre la secrecion liquida epitelial, que refleja con frecuencia la secrecion de aniones (Cl- y/o HCO3-) acoplada con agua (y un contraion cationico) , y la absorcion del liquido epitelial, que con frecuencia refleja la absorcion de Na+, acoplada con agua y

-

un contra-anion (Cl- y/o HCO3) . Muchas enfermedades de las superficies mucosas son causadas por tener muy poco liquido protector sobre estas superficies mucosas, creado por un desequilibrio entre la secrecion (muy poca) y 25 la absorcion (relativamente alta) . Los procesos defectuosos de transporte de sales que caracterizan estas disfunciones de las mucosas residen en la capa epitelial de la superficie mucosa. Un enfoque para reponer la capa protectora de liquido sobre las superficies mucosas es quot;reequilibrarquot; el sistema, por medio el bloqueo de Ia absorcion de liquido mediada por el canal de Na+. La proteina epitelial que media la etapa limitante de la velocidad de la absorcion de Na+ y de liquido es el canal epitelial de Na+ (ENaC) . El alfa-ENaC se coloca sobre la superficie apical 30 del epitelio, es decir, Ia interfase entre el medio ambiente y la superficie mucosa. La inhibicion de la absorcion de liquido mediada por Na+ mediada por alfa-ENaC puede tener utilidad terapeutica. Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar terapias efectivas para el tratamiento y la prevencion de enfermedades o de trastornos en donde este implicado la alfa-ENaC, por ejemplo, fibrosis quistica en seres humanos y animales, y en particular para terapias con una alta eficiencia. Un requisito previo para una alta eficiencia es que el ingrediente activo no se degrade muy rapidamente en un medio ambiente fisiologico.

Li Tianbo y colaboradores, describe como la interferencia del ARN de alfa-ENaC inhibe la absorcion de fluido en el pulmon de rata in vivo, Am Journal of Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L649 - L660, 2006.

Resumen En un primer aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de ARNi que 40 incluye una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde:

a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8453 (SEQ m NO: 1425 ) , y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de ND8453 ( SEQ m NO: 1426 ) , o b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8489 (SEQ m NO:

1497) , y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de ND8489 ( SEQ m NO: 1498) ; o c . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8456 (SEQ ID NO: 1431) , y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos de la cadena antisentido de ND8456 (SEQ ID NO: 1432) .

En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de ARNi para la alfa - ENaC, en donde el agente de ARNi comprende una cadena sentido y una cadena antisentido,

en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8453 (SEQ ID NO: 1425) , ND8489 (SEQ m NO: 1497) , y ND8456 (SEQ ID NO: 1431) , y

en donde la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8453 (SEQ ID NO: 1426) ; ND8489 (SEQ ID NO: 1498) , y ND8456 (SEQ m NO: 1432) ,

la composicion comprende ademas un ligando receptor helicoidal.

En un tercer aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de ARNi como se describio en la presente invencion invencion anteriormente para uso en terapia.

Las composiciones de la invencion, por ejemplo, las composiciones del agente de ARNi pueden ser usadas con cualquier dosis y/o formulacion descrita en la presente invencion invencion, asi como con cualquier ruta de administracion descrita en la presente invencion invencion.

Los detalles de una o mas formas de realizacion de la invencion se exponen en los dibujos acompanantes y la descripcion mas adelante. Otras caracteristicas, objetivos, y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de esta descripcion, de los dibujos, y de las reivindicaciones.

En las Figuras:

Figura 1: Mapa de digestion de restriccion de la construccion pXcon para a-EnaC del cinomologo clonado.

Figura 2: Secuencia de ADN y de la proteina de alfa-ENaC de mono cinomologo.

Figura 3: Clonacion de los sitios de reconocimiento predichos en el objetivo y fuera del objetivo en la construccion del reportero de Iuciferasa dual AY535007. Los fragmentos consisten en 19 nucleotidos del sitio objetivo predicho, y 10 nucleotidos de la secuencia de flanqueo en ambos extremos 5' y 3'.

Descripcion detallada Para mayor facilidad de exposicion, el termino quot;nucleotidoquot; o quot;ribonucleotidoquot; se utiliza algunas veces en la presente invencion invencion con referencia a una o mas subunidades monomericas de un agente de ARN. Se entendera que el uso del termino quot;ribonucleotidoquot; o quot;nucleotidoquot; en la presente invencion invencion puede, en el caso de un ARN modificado o de un sustituto de nucleotido, referirse tambien a un nucleotido modificado, una fraccion de reemplazo sustituta, como se describe adicionalmente mas adelante, en una o mas posiciones.

Un quot;agente de ARNquot;, como se utiliza en la presente invencion invencion, es un ARN no modificado, un ARN modificado, o un sustituto de nucleosido, cada uno de los cuales se describe en la presente invencion invencion o es bien conocido en la tecnica de sintesis de ARN. Aunque se describen numerosos ARN modificados y sustitutos de nucleosidos, los ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen una mayor resistencia a la degradacion de la nucleasa que los ARN no modificados. Los ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen una modificacion del azucar 2', una modificacion en una saliente monocatenaria, preferiblemente una saliente monocatenaria 3', o, particularmente si la cadena monocatenaria es una modificacion 5' que incluye uno o mas grupos fosfato, o uno o mas analogos de un grupo fosfato.

Un quot;agente de ARNiquot; (abreviatura para quot;agente de ARN de interferenciaquot;) , como se utiliza en la presente invencion invencion, es un agente de ARN que puede subregular la expresion de un gen objetivo, por ejemplo un gen SCNN1A para ENaC. Aunque sin animo de cenirnos a ninguna teoria en particular, un agente de ARNi puede actuar mediante uno o mas de una cantidad de mecanismos, incluyendo escision posterior a la transcripcion de un ARNm objetivo algunas veces denominado en la tecnica como ARNi, o mecanismos previos a la transcripcion o previos a la traduccion.

Un quot;agente de ARNi bcquot; (abreviatura para quot;agente de ARNi bicatenarioquot;) , como se utiliza en la presente invencion invencion, es un agente de ARNi que incluye mas de una, y preferiblemente dos cadenas, en donde la hibridacion entre cadenas puede formar una region de estructura duplex. Una quot;cadenaquot; se refiere en Ia presente invencion a una secuencia contigua de nucleotidos (incluyendo nucleotidos que no se presenten naturalmente o modificados)... [Seguir leyendo]

1. Una composicion que comprende un agente de ARNi que contiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde:

a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8453 (SEQ ID NO: 1425 ) , y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de ND8453 ( SEQ m NO: 1426 ) , o

b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8489 (SEQ ID NO: 1497) , y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de ND8489 ( SEQ m NO: 1498) ; o

c . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8456 (SEQ ID NO: 1431) , y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos de la cadena antisentido de ND8456 (SEQ ID NO: 1432) .

2. La composicion de la reivindicacion 1, en donde la cedena sentido es de 30 o menos nucleotidos de longitud, y en donde la cadena sentido y la cadena antisentido forman una region duplex de 15 a 30 pares de nucleotidos de longitud.

3. La composicion de la reivindicacion 1, en donde la cedena antisentido y la cadena sentido son cada una de 19 a 23 nucleotidos de longitud.

4. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende una modificacion que provoca que el agente de ARNi tenga una mayor estabilidad en una muestra biologica.

5. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende un fosforotioato o un nucleotido modificado en 2'.

6. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende:

al menos un dinucleotido d.

5. uridina-adenina-3' (5'-ua-3') , en donde la uridina es un nucleotido modificado en 2'; al menos un dinucleotido d.

5. uridina-guanina-3' (5'-ug-3') , en donde l.

5. uridina es un nucleotido modificado en 2'; al menos un dinucleotido d.

5. citidina-adenina-3' (5'-ca-3') , en donde l.

5. citidina es un nucleotido modificado en 2'; o al menos un dinucleotido d.

5. uridina-uridina-3' (5'-uu-3') , en donde l.

5. uridina es un nucleotido modificado en 2'.

7. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende una modificacion 2' seleccionada a partir del grupo que consiste en.

2. desoxi.

2. desoxi-2'-fluoro.

2. O-metiio.

2. O-metoxi-etilo (2'-O-MOE) .

2. O-aminopropilo (2'-O-AP) .

2. O-dimetºI-amino-etiio (2'-O-DMAOE) .

2. O-dimetil-amino-propilo (2'-O-DMAP) .

2. O-dimetiIamino-etiIoxi-etiio (2'-O-DMAEOE) , .

2. O-N-metiI-acetamido (2'-O-NMA) .

8. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende un extremo romo.

9. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende un nucleotido que sobresale que tiene de 1 a 4 nucleotidos no emparejados.

10. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende un nucleotido que sobresale en el extremo 3' de la cadena antisentido del agente de ARNi.

11. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi es ND8453 (SEQ ID NOs: 1425 y 1426) .

12. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi es ND8489 (SEQ ID NOs: 1497 y 1498) .

13. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi es ND8456 (SEQ ID NOs: 1431 y SEQ ID NO: 1432) .

14. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi esta ligado a uno o mas compuestos de diagnostico, grupo reportero, agente de entrecruzamiento; fraccion que confiera resistencia a Ia nucleasa, nucleobase natural o inusual, molecula Iipofilica, colesterol, lipido, lectina, esteroide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, Friedelina, acido Iitocolico derivado de epifriedelanol, vitamina, carbohidrato, dextrano, pululano, quitina, quitosano, carbohidrato sintetico, Oligo Lactato de 15 mer, polimero natural, polimero de

peso molecular bajo o medio, inulina, ciclodextrina, o acido hialuronico, proteina, agente enlazante de proteina, molecula destinada a la integrina, policationico, peptido, poliamina, imitacion de peptido, y/o transferrina.

15. Una composicion que comprende un agente de ARNi para alfa-ENaC, en donde el agente de ARNi comprende una cadena sentido y una cadena antisentido,

en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8453 (SEQ ID NO: 1425) , ND8489 ( SEQ ID NO: 1497) , y ND8456 ( SEQ ID NO: 1431) , y

en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8453 (SEQ ID NO: 1426) ; ND8489 (SEQ ID NO: 1498) , y ND8456

(SEQ ID NO: 1432) ,

la composicion comprende ademas un ligando del receptor epitelial.

16. La composicion de la reivindicacion 15, en donde el ligando del receptor epitelial es (i) transferrina, o (ii) acido folico.

17. La composicion de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 15 para uso en terapia.

18. La composicion de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 15 para uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por disfuncion del canal de sodio epitelial seleccionada de: fibrosis quistica, discinesia ciliar primaria, bronquitis cronica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD) , asma, infeccion del tracto respiratorio, carninoma pulmonar, sindrome de Liddles, hipertension, insuficiencia renal y desequilibrio de electrolitos.

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