Un método para realizar un ensayo para la actividad de coagulación en una muestra que comprende sangre o plasma de un sujeto caracterizado porque el fosfolípido que es soluble en la muestra es sustituido por las membranas de plaquetas o las membranas sintéticas en el ensayo.

Fosfolípidos solubles para uso en ensayos de factores de coagulación.

La presente invención se refiere a nuevos reactivos y métodos para la realización de ensayos de actividad de coagulación, en particular, nuevos reactivos fosfolípidos solubles y los ensayos de actividad de coagulación que usan éstos.

Antecedentes de la invención

La tradicional vista de la "cascada" de coagulación de la sangre se ilustra en la Figura 1 y consiste de dos vías convergentes: la vía intrínseca o "de contacto" se definió originalmente en base a la adición de arcilla u otros "reactivos de contacto" a la sangre en un tubo de ensayo, y la vía extrínseca que ahora se cree que es la vía por la que se inicia la coagulación después de la lesión del tejido. Ambas vías culminan en la producción del factor Xa de coagulación de la sangre (FXa, una proteasa de serina) por vías que dependen de las membranas. En una de estas, el factor IXa (FIXa, también una proteasa de serina) y su cofactor, el factor VIIIa (FVIIIa) , activan el factor X (FX) en una reacción que depende de las membranas de plaquetas activadas (la vía intrínseca) . En la otra (la vía extrínseca) , el FX se activa por otra proteasa de serina del plasma, el factor de VIIa (FVIIa) en combinación con un cofactor situado en la membrana celular (por lo tanto, "extrínseca" al plasma) , el factor tisular (TF) . Estas dos vías se unen en la "vía común", en la cual el FXa junto con su cofactor el factor Va (FVa) , activa la protrombina a trombina en el paso final en la cascada de coagulación de la sangre. Si bien se cree en general que la exposición del TF al plasma después del daño tisular es el desencadenante que inicia la coagulación de la sangre, también está claro que los complejos dependientes de la membrana de las plaquetas - (Xa-Va, IXa-VIIIa) son esenciales para amplificar el proceso de modo que se forme un coágulo. De hecho, la mayoría de los trastornos de la coagulación familiares implican defectos en estas cuatro proteínas.

La activación de la protrombina se lleva a cabo por el complejo de enzima FXa-FVa, llamado "protrombinasa" en presencia de Ca2+, y membranas cargadas negativamente (Mann, y otros (1990) Blood 76 (1) :1-16; Rosing, y otros (1980) J. Biol. Chem. 255 (1) :274-83) . In vivo, , las membranas se derivan de las plaquetas activadas en forma de vesículas (Sandberg, y otros (1985) Thromb Res 39 (1) : 63-79; Sims, y otros (1989) J. Biol. Chem.264 (29) :17049-57) sobre cuya superficie se expone la fosfatidilserina (PS) (Comfurius, y otros (1990) Biochim. Biophys. Acta 1026 (2) : 15360) , que está enterrada en la superficie citoplásmica de las plaquetas en reposo (Schick, y otros (1976) J. Clin. Invest. 57 (5) :1221-6) . Se sabe que la PS tiene un papel específico en la activación de la protrombina (Jones, y otros (1985) Thrombosis Res. 39, 711-724; Comfurius, y otros (1994) Biochemistr y 33 10319-10324) , pero la naturaleza de ese papel no se ha comprendido aún. Debido a que se deben cortar dos enlaces en la protrombina, la activación puede proceder a través de dos posibles intermediarios proteolíticos (Figura 4) , la meizotrombina (MzIIa) , probablemente el principal intermediario in vivo (Rosing y Tans (1988) Thromb Haemost 60 (3) : 355 -60; Nesheim y Mann (1983) J. Biol. Chem.258 (9) : 5386-91) y la pretromina 2 más el fragmento 1.2. (Pre2 & F1.2; Figura 2) (Nesheim y Mann (1983) supra; Krishnaswamy, y otros (1987) J. Biol. Chem. 262 (7) : 3291-9) . Se cree que el FVa y las membranas de PS dirigen la activación a través del intermedio meizotrombina, pero la PS tiene el papel principal en este sentido (Boskovic, y otros (2001) J. Biol. Chem.276 (31) : 28686-93; Banerjee, y otros (2002) Biochemistr y 41 (3) : 950-7; Wu, y otros (2002) Biochemistr y 41 (3) : 935-49) . El hecho de que la PS tenga este papel significativo, y que también altere la actividad del factor Xa (Koppaka, y otros (1996) Biochemistr y 35:7482) implica un papel regulador para este lípido de las plaquetas.

El factor IX de la coagulación también desempeña un papel fundamental en la coagulación de la sangre como se muestra por la tendencia a la hemorragia asociada con la deficiencia congénita del factor IX (la hemofilia B) . La forma activada del X, FIXa, desempeña un papel clave en la generación de trombina en el tapón de plaquetas por la unión con el FVIIIa sobre las membranas de plaquetas para formar el complejo Xasa que activa X a Xa. Los fosfolípidos cargados negativamente, especialmente la PS, también son esenciales para este proceso. Las membranas que contienen PS aumentan la kcat del complejo factor VIIIa-IXa en más de 1000-veces (Gilbert, y otros (1996) J. Biol. Chem.271 11120) . El FVIIIa y el FIXa se unen específicamente y con gran afinidad a las membranas que contienen PS. Sin embargo, al igual que para el complejo de protrombinasa, el papel exacto de la PS en la activación de FX no se conoce.

La WO 01/44493 describe el uso de fosfolípidos insolubles tales como la cefalina de cerebro de conejo; los fosfolípidos naturales o sintéticos, o las plaquetas en un ensayo para la actividad de coagulación. Sin embargo, hay sólo un limitado intervalo de pacientes para este ensayo. Aunque se ha informado sobre los efectos de los fosfolípidos sobre las actividades del factor IXa (Gilbert y Arena 1997, Biochem. 361, 10768-76) , no se ha observado ni reclamado ningún uso beneficioso en cuanto a su sensibilidad.

Las preparaciones sintéticas de membrana, que se pueden derivar a partir de extractos de fosfolípidos de plaquetas, del cerebro o los pulmones de mamíferos, o la soja, se usan comúnmente en los actuales ensayos de coagulación. Más recientemente, las membranas sintéticas preparadas a partir de mezclas de lípidos sintéticos purificados se han usado para mejorar la reproducibilidad y la vida útil de los ensayos. También están disponibles comercialmente fosfolípidos sintéticos (por ejemplo, de Avanti® Polar Lipids Inc; Alabaster, AL) . Incluso estas preparaciones de membranas sintéticas sufren de los inconvenientes de (1) producirlas es laborioso, (2) cada lote se debe calibrar individualmente para que coincida con los tiempos de coagulación de los patrones existentes (ver, por ejemplo, la patente Estados Unidos núm. 6.596.543 B2 de Wang, y otros) y (3) tienen sólo una vida útil limitada.

En consecuencia, existe una necesidad en la materia de reactivos y métodos mejorados para la realización de ensayos de coagulación y otros ensayos de actividad de los factores de la coagulación.

Breve descripción de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que se pueden usar fosfolípidos solubles en lugar de membranas de plaquetas o membranas sintéticas en ensayos de coagulación y otros ensayos de actividad de coagulación. Los inventores demuestran en la presente que el complejo de protrombinasa desencadenado por el fosfolípido soluble de unión al FXa y FVa humano es totalmente activo (es decir, funcionalmente equivalente al complejo unido a la membrana) en la activación de la protrombina.

Los fosfolípidos solubles de la invención tienen un número de ventajas sobre las vesículas lipídicas convencionales en términos de reproducibilidad, facilidad de fabricación y mejora de la vida útil. Además, las composiciones de fosfolípidos solubles descritos en la presente pueden ser más adecuadas para uso en ensayos de coagulación de sangre o plasma de pacientes con lupus.

Así, en un aspecto, la invención proporciona el uso de un fosfolípido que es soluble en una muestra que comprende sangre o plasma de un sujeto en un ensayo para la actividad de coagulación, en donde el fosfolípido que es soluble en la muestra es sustituido por las membranas de plaquetas o las membranas sintéticas en el ensayo del factor de coagulación.

Como otro aspecto, la invención proporciona un método para realizar un ensayo para la actividad de coagulación en una muestra que comprende sangre o plasma de un sujeto, caracterizado porque el fosfolípido que es soluble en la muestra se sustituye por las membranas de plaquetas o la membrana sintética en el ensayo.

La invención proporciona un método de evaluación de la actividad de coagulación que comprende:

(a) combinar una muestra que comprende sangre o plasma con:

(i) un fosfolípido que es soluble en la muestra;

(ii) un activador de contacto; y

(iii) calcio;

(b) incubar la mezcla de (a) anterior, durante... [Seguir leyendo]

1. Un método para realizar un ensayo para la actividad de coagulación en una muestra que comprende sangre o plasma de un sujeto caracterizado porque el fosfolípido que es soluble en la muestra es sustituido por las membranas de plaquetas o las membranas sintéticas en el ensayo.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el ensayo es un ensayo de coagulación de vía intrínseca.

3. Un método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende:

(a) combinar una muestra que comprende sangre o plasma con:

(i) un fosfolípido que es soluble en la muestra;

(ii) un activador de contacto; y

(iii) calcio;

(b) incubar la mezcla de (a) anterior, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la activación de la protrombina; y

(c) detectar la actividad del factor Xa o la trombina, en la que la actividad del factor Xa o la trombina es indicativa de la actividad del factor de coagulación en la muestra.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el fosfolípido que es soluble en la muestra no contiene agregados detectables como se determinó por la dispersión cuasi-eléctrica de la luz.

5. El método de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la muestra se combina adicionalmente con Proteína C activada o un activador de Proteína C, en donde el nivel de actividad de la trombina es indicativo de la resistencia Proteína C activada en la muestra.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la muestra se combina adicionalmente con plasma empobrecido en Proteína S, en donde el nivel de actividad de la trombina es indicativo de los niveles de la Proteína S en la muestra.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a la reivindicación 6, en donde la sample se combina adicionalmente con un plasma seleccionado del grupo que consiste de:

(a) plasma conocido por ser deficiente para un factor de coagulación particular; y

(b) plasma normal.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a la reivindicación 7, en donde la actividad enzimática de la trombina se mide, que además comprende opcionalmente la etapa de comparar la actividad de la trombina detectada con un estándar, o en donde se detecta la formación del coágulo.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende:

(a) combinar una muestra que comprende sangre o plasma con:

(i) un fosfolípido que es soluble en la muestra;

(ii) un activador de contacto; y

(iii) calcio;

(b) incubar la mezcla de (a) anterior, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación del coágulo.

10. El método de la reivindicación 9, que además comprende:

(c) determinar un tiempo de coagulación para la muestra; y opcionalmente

(d) comparar el tiempo de coagulación determinado para la muestra con un estándar.

11. Un método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende:

(a) combinar una muestra que comprende plasma con:

(i) un fosfolípido que es soluble en la muestra;

(ii) el factor tisular soluble; y

(iii) calcio;

(b) incubar la mezcla de (a) anterior, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la activación de la protrombina; y

(c) detectar la actividad de la trombina, en donde la actividad de la trombina es indicativa de la actividad del factor VIIa en la muestra.

12. Un método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende:

(a) combinar una muestra que comprende plasma con:

(i) un fosfolípido que es soluble en la muestra;

(ii) el factor X exógeno;

(iii) los factores de la coagulación activados dependientes de fosfolípidos diferentes del factor X que son dependientes del factor de coagulación que se evalúa en la vía intrínseca de la coagulación o se requieren para la activación del factor de coagulación que se evalúa; y

(iv) calcio;

(b) incubar la mezcla de (a) anterior, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la activación del factor X a factor Xa; y

(c) detectar la actividad del factor Xa, en donde la actividad del factor Xa es indicativa de la actividad del factor de coagulación en la muestra.

13. El método de la reivindicación 12, en donde se detecta la actividad del Factor Xa: (a) por un ensayo espectrofotométrico para el Factor Xa;

(b) mediante la detección de la actividad de la trombina en la muestra; o

(c) mediante la detección de la formación del coágulo.

14. El método de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde el método se lleva a cabo para evaluar la actividad de FVIIIa, el método comprende:

(a) combinar una muestra que comprende plasma con:

(i) un fosfolípido que es soluble en la muestra;

(ii) el factor X exógeno;

(iii) el factor Factor IXa exógeno; y

(iv) calcio;

(b) incubar la mezcla de (a) anterior, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la activación del factor X a factor Xa; y

(c) detectar la actividad del Factor Xa, en donde la actividad del Factor Xa es indicativa de la actividad del Factor VIIIa en la muestra.

15. El método de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde el método se lleva a cabo para evaluar la actividad del Factor IXa, el método comprende:

(a) combinar una muestra que comprende plasma con:

(i) un fosfolípido que es soluble en la muestra;

(ii) el factor X exógeno;

(iii) el factor VIIIa exógeno o FVIII exógeno y un activador FVIII ; y

(iv) calcio;

(b) incubar la mezcla de (a) anterior, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la activación del factor X a factor Xa; y

(c) detectar la actividad del Factor Xa, en donde la actividad del Factor Xa es indicativa de la actividad del Factor IXa en la muestra.

16. El método de la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde la muestra se combina adicionalmente con trombina.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el fosfolípido que es soluble en la muestra consiste prácticamente de un fosfolípido seleccionado del grupo que consiste de fosfatidilserina, fosafatidilhomoserina, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, y una combinación de éstos.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el fosfolípido que es soluble en la muestra comprende ácidos grasos acilados C2 a C14 o C16, o ácidos grasos acilados C4 a C10 o C12 o C6 fosfatidilserina.

19. El método de la reivindicación 17, en donde el fosfolípido que es soluble en la muestra consiste de ácidos grasos acilados C4 a C10 o C12 o C6 fosfatidilserina.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el fosfolípido que es soluble en la muestra se añade a una concentración final de 4 μM a 2 mM.

21. El método de la reivindicación 20 en donde dicho fosfolípido se añade a una concentración final de al menos 50 μM y menos que 2 mM.

22. El método de la reivindicación 21 en donde dicho fosfolípido se añade a una concentración final de al menos 100 μM y menos que 2 mM.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la sangre o plasma es sangre o plasma humano.

24. Uso de un fosfolípido que es soluble en una muestra que comprende sangre o plasma de un sujeto en un ensayo para la actividad de coagulación, en donde el fosfolípido que es soluble en la muestra es sustituido por las membranas de plaquetas o las membranas sintéticas en el ensayo del factor de coagulación.

25. El uso de la reivindicación 24, en donde el ensayo es de actividad de coagulación de vía intrínseca.

26. El método o uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la muestra es de un sujeto con lupus.

27. Una composición de ensayo que comprende:

(a) una muestra de plasma;

(b) un fosfolípido que es soluble en la muestra;

(c) un reactivo seleccionado del grupo que consiste de (i) un activador de contacto, (ii) un factor tisular soluble, y (iii) Factor X exógeno;

(d) calcio; y, opcionalmente,

(e) Factor IXa exógeno;

en donde la composición de ensayo no contiene membranas de plaquetas o membranas sintéticas añadidas exógenamente.