Emulsiones de aceite en agua microfluidizadas y composiciones de vacunas.

Una emulsión submicrométrica microfluidizada de aceite en agua que comprende un aceite nometabolizable de hidrocarburo ligero,

un tensioactivo y un componente acuoso, estando disperso dicho aceite endicho componente acuoso con un tamaño medio de gota de aceite inferior a 0,5 μm.

Emulsiones de aceite en agua microfluidizadas y composiciones de vacunas Campo de la invención La presente invención se refiere de forma general al campo de las vacunas y, en particular, a formulaciones decoadyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria en animales veterinarios. En particular, la invención se refiereal uso de una emulsión submicrométrica de aceite en agua como un coadyuvante de vacunas para potenciar lacapacidad inmunógena de los antígenos. La presente invención proporciona formulaciones de emulsiones submicrométricas de aceite en agua, composiciones de vacunas que contienen un antígeno incorporado en dichaemulsión, así como procedimientos para preparar las emulsiones y vacunas.

Antecedentes de la invención Las infecciones bacterianas, víricas, parasitarias y micoplásmicas están ampliamente difundidas en los animalesveterinarios tales como ganado vacuno, porcino y animales de compañía. Las enfermedades provocadas por estosagentes infecciosos son a menudo resistentes a la terapia farmacéutica antimicrobiana, sin dejar medios efectivosde tratamiento. En consecuencia, cada vez se usa más una estrategia de vacunación para controlar la enfermedad infecciosa en los animales veterinarios. Un patógeno infeccioso entero puede hacerse adecuado para su uso en una formulación de vacuna después de la inactivación química o manipulación genética apropiada. De forma alternativa, puede expresarse una subunidad proteínica del patógeno en un sistema de expresión recombinante y purificarsepara su uso en una formulación de vacuna.

Coadyuvante, en general, se refiere a cualquier material que aumenta la respuesta inmunitaria humoral y/o celular aun antígeno. Las vacunas tradicionales están compuestas por una preparación bruta de microorganismos patógenos inactivados y las impurezas asociadas a los cultivos de microorganismos patológicos podrían actuar comocoadyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria. Sin embargo, cuando se usan preparaciones homogéneas demicroorganismos patológicos o subunidades proteínicas purificadas como antígenos para la vacunación, la inmunidad provocada por dichos antígenos es deficiente y, por lo tanto, se hace necesaria la adición de ciertos materiales exógenos como coadyuvantes. Además, las vacunas sintéticas y de subunidades son caras de producir.Por lo tanto, con la ayuda de coadyuvantes, puede ser necesaria una dosis menor de antígeno para estimular larespuesta inmunitaria, reduciendo así en el coste de producción de las vacunas.

Se sabe que los coadyuvantes actúan de diferentes maneras para potenciar la respuesta inmunitaria. Muchoscoadyuvantes modifican la red de citocinas asociadas a la respuesta inmunitaria. Estos coadyuvantesinmunomoduladores pueden ejercer su efecto incluso cuando no están combinados con antígenos. En general, loscoadyuvantes inmunomoduladores provocan una regulación por aumento general de ciertas citocinas y una regulación por disminución concomitante de otras provocando una respuesta celular Th1 y/o humoral Th2.

Algunos coadyuvantes tienen la capacidad de preservar la integridad de la conformación de un antígeno de formaque los antígenos puedan presentarse de forma eficaz a las células efectoras inmunitarias apropiadas. Comoresultado de esta preservación de la conformación del antígeno por la formulación del coadyuvante, la vacunatendría una vida útil mayor que la mostrada por los complejos inmunoestimuladores (ISCOM) . Ozel M. y col.; Quaternar y Structure of the Immunestimmulating Complex (Iscom) , J. of Ultrastruc. And Molec. Struc. Res. 102, 240248 (1989) .

Algunos coadyuvantes tienen la propiedad de retener el antígeno en forma de formulación de liberación prolongadaen el sitio de inyección. Como resultado de este efecto de liberación prolongada el antígeno no se pierderápidamente por aclaramiento hepático. Las sales de aluminio y las emulsiones de agua en aceite actúan a través deeste efecto de liberación prolongada con una duración menor. Por ejemplo, se puede obtener una formulación deliberación prolongada a largo plazo usando coadyuvante completo de Freund (FCA) que es una emulsión de agua en aceite. El FCA normalmente se mantiene en el sitio de inyección hasta que la biodegradación permite laseparación del antígeno por las células que presentan antígeno.

Basándose en su naturaleza física, los coadyuvantes pueden agruparse en dos categorías muy amplias, en concretocoadyuvantes particulados y coadyuvantes no particulados. Los coadyuvantes particulados existen en forma demicropartículas. El inmunógeno es capaz de incorporar o asociarse a las micropartículas. Sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, complejos inmunoestimuladores, liposomas ynanopartículas y micropartículas son ejemplos de coadyuvantes particulados. Los coadyuvantes no particulados son generalmente inmunomoduladores y se usan generalmente junto con coadyuvantes particulados. Muramil dipéptido (un componente activo-adyuvante de un peptidoglicano extraído de Mycobacteria) , copolímeros de bloque no iónicos, saponinas (una mezcla compleja de triterpenoides extraídos de la corteza del árbol Quillaja saponaria) , Lípido A (un disacárido de glucosamina con dos grupos fosfato y cinco o seis cadenas de ácidos grasos generalmente de C12 a C16 de longitud) , citocinas, polímeros de carbohidratos, polisacáridos derivatizados y toxinas bacterianas tales como la toxina del cólera y la toxina lábil de E. coli (LT) son ejemplos de coadyuvantes no particulados.

Algunos de los coadyuvantes mejor conocidos son combinaciones de inmunomoduladores no particulados y materiales particulados que podrían conferir un efecto de liberación prolongada a la formulación de coadyuvante. Porejemplo, FCA combina las propiedades inmunomoduladoras de componentes de Mycobacterium tuberculosis con el efecto depósito a corto plazo de las emulsiones en aceite.

Las emulsiones en aceite se han usado como coadyuvante de vacunas durante mucho tiempo. Le Moignic y Pinoyencontraron en 1916 que una suspensión de Salmonella typhimurium inactivados en aceite mineral aumentaba la respuesta inmunitaria. Subsiguientemente, en 1925, Ramon describió el aceite de almidón como una de las sustancias que aumentan la respuesta antitóxica al toxoide de la difteria. Sin embargo, las emulsiones en aceite nose hicieron populares hasta 1937 cuando Freund logró su formulación de coadyuvante que hoy se conoce comocoadyuvante Completo de Freund (FCA) . El FCA es una emulsión de agua en aceite compuesta por aceite mineral (parafina) mezclado con Mycobacteria inactivadas y Arlacel A. Arlacel A es principalmente monooleato de manida y se usa como agente emulsionante. Aunque FCA es excelente para inducir una respuesta de anticuerpos, provoca undolor fuerte, formación de abcesos, fiebre e inflamación granulomatosa. Para evitar estas reacciones secundariasindeseables, se desarrolló el coadyuvante Incompleto de Freund (IFA) . El IFA es similar al FCA en su composiciónexcepto por la ausencia de componentes de micobacteria. El IFA actúa mediante formulación de liberación prolongada en el sitio de inyección y liberación lenta del antígeno con estimulación de células productoras deanticuerpos.

Otra estrategia para mejorar FCA se basó en la noción de que la sustitución del aceite mineral por un aceitebiocompatible ayudaría a eliminar las reacciones asociadas a FCA en el sitio de inyección. Se creía también que laemulsión debería ser una de aceite en agua en lugar de agua en aceite porque ésta produce efecto de liberaciónprolongada de larga duración en el sitio de inyección. Hilleman y col. describieron un coadyuvante basado en aceite“Adjuvant 65”, que consiste en aceite de cacahuete al 86 %, Arlacel A al 10 % como emulsionante y monoestearato de aluminio al 4 % como estabilizante. Hilleman, 1966, Prog. Med. Virol. 8: 131-182; Hilleman y Beale, 1983, en NewApproaches to Vaccine Development (Editores Bell, R. y Torrigiani, G.) , Schwabe, Basilea, Suiza. En los sereshumanos, el uso de Adjuvant 65 era seguro y potente, pero mostraba menos capacidad coadyuvante que IFA. Sin embargo, se suspendió el uso de Adjuvant 65 debido a la capacidad reactógena en el hombre con ciertos lotes devacunas y la reducción de la capacidad de coadyuvante cuando se usaba emulsionante purificado o sintético enlugar de Arlacel A. Las patentes de Estados Unidos nº 5.718.904 y 5.690.942 enseñan que el aceite mineral en laemulsión de aceite en agua puede sustituirse por aceite metabolizable con el fin de mejorar el perfil de seguridad.

Además de la capacidad coadyuvante y la seguridad, el aspecto físico de una emulsión es también una consideración comercial importante. El aspecto físico depende de la estabilidad... [Seguir leyendo]

1. Una emulsión submicrométrica microfluidizada de aceite en agua que comprende un aceite no metabolizable de hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso, estando disperso dicho aceite endicho componente acuoso con un tamaño medio de gota de aceite inferior a 0, 5 μm.

2. La emulsión de la reivindicación 1, en la que dicho aceite es aceite mineral ligero y está en una cantidad del1 % al 50 % v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está en una cantidad del 0, 01 % al 10 % v/v, y en la quedicho aceite está disperso en dicho componente acuoso y el tamaño medio de gota de aceite se encuentra entre 0, 1μm y 0, 5 μm.

3. La emulsión de la reivindicación 1, en la que el aceite no metabolizable es aproximadamente el 40 % v/v deaceite mineral, el tensioactivo comprende aproximadamente el 10 % p/v de lecitina, aproximadamente el 0, 18 % v/vde ésteres de ácidos grasos de sorbitol polietoxilado y aproximadamente el 0, 08 % v/v de tensioactivos de sorbitansustituidos con ácidos grasos, en la que dicho aceite está disperso en dicho componente acuoso y el tamaño mediode gota de aceite se encuentra entre 0, 1 μm y 0, 5 μm.

4. Un procedimiento para preparar una emulsión submicrométrica de aceite en agua de la reivindicación 1, que comprende:

(a) preparar una mezcla combinando un aceite no metabolizable de hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso;

(b) someter dicha mezcla a un procedimiento de emulsionamiento primario para producir una emulsión deaceite en agua que tiene un tamaño medio de gota de aceite de 1, 0 μm a 1, 1 μm; y

(c) someter la emulsión de aceite en agua preparada en (b) a microfluidización para producir dicha emulsiónsubmicrométrica de aceite en agua, en el que la emulsión submicrométrica tiene un tamaño medio de gota de aceiteinferior a 0, 5 μm.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho aceite es aceite mineral ligero y está en unacantidad del 1 % al 50 % v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está en una cantidad del 0, 01 % al 10 % v/v y en el que dicho tamaño medio de gota de aceite de dicha emulsión submicrométrica está entre 0, 1 μm y 0, 5 μm.

6. Una composición de vacuna que comprende una emulsión de aceite en agua de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un antígeno, estando dicho antígeno disperso en dicha emulsión.

7. Una composición de vacuna que comprende una emulsión de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho antígeno está disperso en dicha emulsión y, además, en la que dicho aceite es aceite mineral ligero y está presenteen dicha composición de vacuna en una cantidad del 1 % al 20 % v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y estápresente en dicha composición de vacuna en una cantidad del 0, 01 % al 10 % v/v, y en la que dicho tamaño mediode gota de aceite está entre 0, 1 μm y 0, 5 μm.

8. La composición de vacuna de la reivindicación 6 o 7, en la que dicho antígeno es un antígeno vírico o unantígeno bacteriano.

9. La composición de vacuna de la reivindicación 8, en la que dicho antígeno vírico comprende Virus deDiarrea Bovino Tipo 1 o Tipo 2 inactivado y en la que dicho antígeno bacteriano comprende al menos uno de entreuna bacterina de Leptospira inactivada, la proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante o una preparación de células de E. coli.

10. Un procedimiento para preparar una composición de vacuna de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, que comprende:

(a) preparar una mezcla combinando un aceite no metabolizable de hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso;

(b) añadir un antígeno a la mezcla formada en (a) ;

(c) someter la mezcla que contiene dicho antígeno, que se forma en (b) , a un procedimiento deemulsionamiento primario para producir una emulsión de aceite en agua que tiene un tamaño medio de gota deaceite de 1, 0 μm a 1, 1 μm; y

(d) someter la emulsión formada en (c) a microfluidización para producir dicha composición de vacuna, en elque la composición tiene un tamaño medio de gota de aceite inferior a 0, 5 μm.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho antígeno es un antígeno vírico o un antígenobacteriano.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho antígeno vírico comprende Virus de DiarreaBovino Tipo 1 o Tipo 2 inactivado y en el que dicho antígeno bacteriano comprende al menos uno de entre una bacterina de Leptospira inactivada, la proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante o una preparación de células de E. coli.

13. Una composición de vacuna que comprende un antígeno microencapsulado y una emulsión de aceite enagua de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicho antígeno microencapsulado está disperso en dicha

emulsión.

14. Una composición de vacuna que comprende un antígeno microencapsulado y una emulsión de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho antígeno está disperso en dicha emulsión y, además, dicho aceite es aceite

mineral ligero y está presente en dicha composición de vacuna en una cantidad del 1, 0 % al 20 % v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está presente en dicha composición de vacuna en una cantidad de 0, 01 % a 10 %v/v, dicho antígeno es un antígeno vírico o un antígeno bacteriano y está encapsulado en un vehículo particulado, y en la que dicho vehículo comprende ácido polilactidaglicólico.

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Media de mínimos cuadrados de Valoración de anticuerpos temperatura rectal ( ºC) neutralizadores

Mes 0 Mes 6 Mes 12 Mes 24

Figura 6

Día del estudio

Figura 7

Media por mínimos cuadrados del volumen de reacción del sitio de inyección (cm3)

Día del estudio

Figura 8

Figura 9

Días del experimento

Figura 10A

% volumen

Diámetro de partícula (μm)

Figura 10B

% volumen Diámetro de partícula (μm)