Anticuerpos neutralizantes de citomegalovirus humano y su uso.

Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno que se une a citomegalovirus humano (CMVh) y que es específico de una combinación de las proteínas de CMVh UL130 y UL131A,

formando la combinación el epítopo reconocido por dicho anticuerpo o fragmento que se une y que neutraliza una infección de células endoteliales, células epiteliales, células de la retina y células dendríticas mediante CMVh, en donde el anticuerpo o el fragmento comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 85% de identidad con SEQ ID NOs 7 y 8 respectivamente, SEQ ID NOs 17 y 18 respectivamente, SEQ ID NOs 39 y 40 respectivamente o SEQ ID NOs 49 y 18 respectivamente.

Anticuerpos neutralizantes de citomegalovirus humano y su uso Campo técnico Esta invención se refiere a anticuerpos que tienen especificidad hacia el citomegalovirus humano, a anticuerpos monoclonales adecuados que tienen esa especificidad y a linfocitos B inmortalizados que producen tales anticuerpos monoclonales. En esta memoria se describen epítopos que se unen a los anticuerpos así como el uso de los anticuerpos y los epítopos en métodos de cribado, así como en el diagnóstico, profilaxis y terapia de una enfermedad.

Técnica anterior

El citomegalovirus humano (CMVh) es un agente patógeno ampliamente distribuido que puede causar una patología grave en adultos inmunodeprimidos y después de una infección del feto, y se ha implicado en enfermedades crónicas tales como la aterosclerosis. El CMVh infecta múltiples tipos de células incluyendo los fibroblastos, las células endoteliales, epiteliales y hematopoyéticas [1]. Las cepas atenuadas de CMVh propagadas in vitro, que se están desarrollando como vacunas candidatas, han perdido el tropismo hacia las células endoteliales, mientras que conservan la capacidad de infectar fibroblastos [2]. Recientemente, se ha mostrado que dos complejos de glicoproteínas víricas controlan el tropismo celular de CMVh. Para la infección de fibroblastos se requiere un complejo de gH, gL y gO, mientras que un complejo de gH, gL y proteínas codificadas por los genes UL131-UL128 son responsables de la infección de las células endoteliales, las células epiteliales y las células dendríticas [2-8].

Las globulinas hiperinmunes ya se comercializan para la profilaxis de la enfermedad por CMVh asociada con trasplante, y una evidencia reciente indica que tienen un efecto terapéutico en las mujeres embarazadas [9]. Este enfoque terapéutico está limitado por la baja cantidad de anticuerpos neutralizantes que se puede transferir y por esta razón, sería muy deseable la disponibilidad de anticuerpos humanos (tales como anticuerpos monoclonales humanos) con una capacidad de neutralización elevada. Sin embargo, aún no se ha establecido la diana de los anticuerpos neutralizantes de CMVh. Un trabajo previo identificó gB y gH como dianas potenciales. Sin embargo, un anticuerpo humanizado para gH (MSL 109) no mostró ningún efecto significativo en un ensayo clínico [10, 11]. Todos los anticuerpos neutralizantes descritos hasta la fecha tenían una capacidad neutralizante reducida ya que neutralizan la infección con CMVh solo a concentraciones elevadas. Por ejemplo, el anticuerpo MSL-109 solo mostraba un 50% de actividad neutralizante a una concentración de 10 μg/ml, un hecho que podría explicar la falta de un efecto in vivo [11]. La potencia neutralizante de los anticuerpos anti-CMVh se mide típicamente usando fibroblastos como células diana. Sin embargo, se sabe que el CMVh causa patología infectando otros tipos de células, tales como las células epiteliales, endoteliales y leucocitos. No parece haber ningún anticuerpo monoclonal disponible que sea capaz de neutralizar con alta potencia una infección de células diana no fibroblastos. Los anticuerpos neutralizantes descritos recientemente para UL128 y UL130 también mostraron una potencia muy baja en la neutralización de la infección de células endoteliales [7].

Un anticuerpo monoclonal humano contra CMV, denominado SDZ MSL 109, es producido por la línea celular de hibridoma EV 2-7 que tiene el número de orden NCACC 85 100 803 [43].

Por tanto, se requiere la producción de anticuerpos neutralizantes de CMVh, así como el esclarecimiento de la diana a la que se unen dichos anticuerpos.

Descripción de la invención La invención se basa en la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que neutralizan la infección con CMVh y que tienen una potencia particularmente alta para neutralizar la infección con CMVh. Tales anticuerpos son deseables, ya que solo se requieren concentraciones bajas con el fin de neutralizar una cantidad dada de virus. Esto facilita unos niveles de protección más elevados, aunque se administran menores cantidades de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales humanos y los clones de linfocitos B inmortalizados que secretan tales anticuerpos, también se incluyen dentro del alcance de la invención.

Los inventores han descubierto que anticuerpos dirigidos a una combinación de UL130 y UL131A son particularmente eficaces en la neutralización de CMVh. La combinación puede ser un complejo de UL130 y UL131A que forma un epítopo reconocido por el anticuerpo o un anticuerpo se puede dirigir a uno de UL130 y UL131A, siendo necesaria la presencia de la otra proteína para la especificidad.

Por lo tanto, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno que se une a citomegalovirus humano (CMVh) y que es específico de una combinación de las proteínas del CMVh UL130 y UL131A, formando la combinación el epítopo reconocido por dicho anticuerpo o fragmento que se une y neutraliza una infección de células endoteliales, células epiteliales, células de la retina y células dendríticas mediante CMVh, en donde el anticuerpo o el fragmento comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 85% de identidad con SEQ ID NOs 7 y 8 respectivamente, SEQ ID NOs 17 y 18 respectivamente, SEQ ID NOs 39 y 40 respectivamente o SEQ ID NOs 49 y 18 respectivamente.

La invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno que se une a citomegalovirus humano (CMVh) y que neutraliza la infección de células endoteliales, células epiteliales, células de la retina y células dendríticas mediante CMVh, y que es específico de una combinación de proteínas de CMVh UL130 y UL131A, formando la combinación el epítopo reconocido por dicho anticuerpo o fragmento que se une, en donde el anticuerpo o el fragmento (a) comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7 y 8 respectivamente, SEQ ID NOs: 17 y 18 respectivamente, SEQ ID NOs: 39 y 40 respectivamente o SEQ ID NOs: 49 y 18 respectivamente; (b) comprende secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena pesada como se describen en SEQ ID NOs: 1, 2 y 3 respectivamente, y secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena ligera como se describen en SEQ ID NOs: 4, 5 y 6 respectivamente; (c) comprende secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena pesada como se describen en SEQ ID NOs: 11, 12 y 13 respectivamente, y secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena ligera como se describen en SEQ ID NOs: 14, 15 y 16 respectivamente; o (d) comprende secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena pesada como se describen en SEQ ID NOs: 33, 34 y 35 respectivamente, y secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena ligera como se describen en SEQ ID NOs: 36, 37 y 38 respectivamente, para uso en un método de tratamiento o prevención de una infección con CMVh.

Anticuerpos de la invención La invención proporciona anticuerpos monoclonales o recombinantes que tienen una potencia particularmente alta para neutralizar CMVh. La invención también proporciona fragmentos de estos anticuerpos recombinantes o monoclonales, en particular fragmentos que conservan la actividad de unión al antígeno de los anticuerpos, por ejemplo, que conservan al menos una región determinante de complementariedad (CDR) específica de las proteínas de CMVh UL130 y UL131A.

En esta memoria descriptiva, por "potencia elevada para neutralizar CMVh" se entiende que una molécula de anticuerpo de la invención neutraliza CMVh en un ensayo convencional a una concentración mucho menor que los anticuerpos conocidos en la técnica, por ejemplo, en comparación con MSL-109.

Preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la presente invención puede neutralizar a una concentración de 0, 16 μg/ml o inferior (es decir, 0, 15, 0, 125, 0, 1, 0, 075, 0, 05, 0, 025, 0, 02, 0, 016, 0, 015, 0, 0125, 0, 01, 0, 0075, 0, 005, 0, 004

o menor) , preferiblemente 0, 016 μg/ml o inferior (una concentración de anticuerpo de 10-8 o inferior, preferiblemente 10-9 M o inferior, preferiblemente 10-10 M o inferior, es decir, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M o inferior) . Esto significa que solo se requieren concentraciones muy bajas de anticuerpo para neutralizar el 50% de una cepa clínica aislada de CMVh in vitro, en comparación con la concentración requerida de MSL-109 para neutralizar el mismo título de CMVh. Preferiblemente, la concentración de anticuerpo de la invención para neutralizar el 50% de la infección de células endoteliales, células epiteliales y células dendríticas con una cepa clínica aislada de CMVh, es 50 veces o más (es decir, 75, 100, 150, 200 o más) menor que la requerida con MSL-109. La potencia se puede medir... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno que se une a citomegalovirus humano (CMVh) y que es específico de una combinación de las proteínas de CMVh UL130 y UL131A, formando la combinación el epítopo reconocido por dicho anticuerpo o fragmento que se une y que neutraliza una infección de células endoteliales, células epiteliales, células de la retina y células dendríticas mediante CMVh, en donde el anticuerpo o el fragmento comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 85% de identidad con SEQ ID NOs 7 y 8 respectivamente, SEQ ID NOs 17 y 18 respectivamente, SEQ ID NOs 39 y 40 respectivamente o SEQ ID NOs 49 y 18 respectivamente.

2. El anticuerpo o el fragmento que se une a antígeno según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende

(i) una cadena pesada que comprende un polipéptido con SEQ ID NO: 1 para CDRH1, SEQ ID NO: 2 para CDRH2 y SEQ ID NO: 3 para CDRH3 y una cadena ligera que comprende un polipéptido SEQ ID NO: 4 para CDRL1, SEQ ID NO: 5 para CDRL2 y SEQ ID NO: 6 para CDRL3 o (ii) una cadena pesada que comprende un polipéptido con SEQ ID NO: 11 para CDRH1, SEQ ID NO: 12 para CDRH2 y SEQ ID NO: 13 para CDRH3 y una cadena ligera que comprende un polipéptido con SEQ ID NO: 14 para CDRL1, SEQ ID NO: 15 para CDRL2 y SEQ ID NO: 16 para CDRL3;

o (iii) una cadena pesada que comprende un polipéptido con SEQ ID NO: 33 para CDRH1, SEQ ID NO: 34 para CDRH2 y SEQ ID NO: 35 para CDRH3 y una cadena ligera que comprende un polipéptido con SEQ ID NO: 36 para CDRL1, SEQ ID NO: 37 para CDRL2 y SEQ ID NO: 38 para CDRL3.

3. El anticuerpo o el fragmento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo o fragmento se une a un epítopo conformacional formado por las proteínas UL130 y UL131A.

4. El anticuerpo o el fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo de cadena sencilla, Fab, Fab’, F (ab’) 2, Fv o scFv.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo

o el fragmento de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

6. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 5.

7. Una célula transformada con un vector de expresión según la reivindicación 6.

8. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento que se une a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. La composición según la reivindicación 8, que comprende adicionalmente un segundo anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno, que neutraliza la infección con CMVh.

10. La composición según la reivindicación 8, que comprende un primer anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno según se ha definido en la reivindicación 1, y un segundo anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno, que se une a una proteína gH de CMVh o una proteína gB de CMVh.

11. Un anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para uso en un método para tratar o prevenir una infección con CMVh.

12. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno que se une a citomegalovirus humano (CMVh) y neutraliza la infección de células endoteliales, células epiteliales, células de la retina y células dendríticas mediante CMVh, y que es específico de una combinación de proteínas de CMVh UL130 y UL131A, formando la combinación el epítopo reconocido por dicho anticuerpo o fragmento que se une, en donde el anticuerpo o el fragmento

(a) comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7 y 8 respectivamente, SEQ ID NOs: 17 y 18 respectivamente, SEQ ID NOs: 39 y 40 respectivamente o SEQ ID NOs: 49 y 18 respectivamente;

(b) comprende secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena pesada como se describen en SEQ ID NOs: 1, 2 y 3 respectivamente, y secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena ligera como se describen en SEQ ID NOs: 4, 5 y 6 respectivamente;

(c) comprende secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena pesada como se describen en SEQ ID NOs: 11, 12 y 13 respectivamente, y secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena ligera como se describen en SEQ ID NOs: 14, 15 y 16 respectivamente; o

(d) comprende secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena pesada como se describen en SEQ ID NOs: 33, 34 y 35 respectivamente, y secuencias de CDR 1, 2 y 3 de la cadena ligera como se describen en SEQ ID NOs: 36, 37 y 38 respectivamente,

para uso en un método de tratamiento o prevención de una infección con CMVh.

13. Un método para producir anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende (i) cultivar una célula según la reivindicación 7 y (ii) aislar anticuerpos.