Método para la detección de células inmunitarias específicas de antígeno en líquidos extrasanguíneos.

Método para la detección mejorada de células inmunitarias específicas de antígeno en líquidos extrasanguíneos,

consistente en los pasos siguientes:

- el aislamiento de las células inmunitarias vitales a partir de un líquido extrasanguíneo mediante los pasos de lavado y de centrifugación adecuados, p.ej. mediante la aplicación de suero fisiológico como tampón de lavado y de centrifugación a 200 hasta 500 g,

- la determinación del número total de células, por ejemplo, para cada preparación de estimulación se necesitan de 105 a 1,5x106 células,

- la tinción previa de las células inmunitarias aisladas con un anticuerpo acoplado a un fluorocromo que se dirige contra los antígenos expresados en las células, p.ej. CD45, o mediante fluorocromos adecuados para la tinción de células vitales, p.ej., succinimidil éster de diacetato de carboxifluoresceína, CFDA-SE,

- la eliminación de anticuerpos o fluorocromos no unidos mediante pasos de lavado, caracterizado por

- la mezcla de las células inmunitarias teñidas previamente con sangre total heparinizada de la misma persona,

- la estimulación de las muestras mezcladas con el antígeno de interés, con o sin adición de anticuerpos coestimulantes anti-CD49d y anti-CD28, anti-CD49d solo o anti-CD28 solo,

- la incubación durante 30 min a 4 h a 35 hasta 39 °C y 3 a 10% de CO2,

- la adición de un inhibidor de secreción, p.ej. brefeldina A, monensina u otros,

- la incubación durante 2 a 12 horas a 35 hasta 39 °C y 3 a 10% de CO2,

- la lisis de eritrocitos y fijación de los leucocitos,

- pasos de lavado para el aislamiento de los leucocitos,

- aumento de la permeabilidad de la membrana celular mediante la adición de una sustancia que aumenta la permeabilidad de la membrana celular, p.ej. saponina,

- la incubación con anticuerpos específicos marcados con fluorocromo contra marcadores de activación, p.ej., anti-CD69, anti-IFN-γ, durante al menos 10 min en hielo o a temperatura ambiente o a 35 hasta 39°C,

- nuevos pasos de lavado para la eliminación de los anticuerpos no unidos,

- el análisis de las células en un citómetro de flujo y la discriminación de las células inmunitarias del líquido extrasanguíneo de las de la sangre por medio de la señal fluorescente que se utilizó para la tinción previa, p.ej., fluorocromo del anticuerpo-CD45, CFSE, donde las células reactivas contra el estímulo se distinguen de las células no reactivas mediante la positividad respecto a los marcadores de activación.