Método para el aislamiento eficiente del ADN microbiano de la sangre.
Un método para el aislamiento simultáneo de ADN microbiano de la sangre,
usando lisis enzimática, mecánica y térmica que permite obtener ADN de todos los tipos de organismos en una sonda de muestra, independientemente de la estructura de las células, en el que:
a) la muestra de sangre completa se agrega a una solución acuosa de cloruro de amonio a una concentración de 0,10- 0,25 M, en una proporción de 1:3 a 1:6 al volumen de la muestra de sangre, la muestra se incuba a una temperatura de 35 °C a 40 °C, durante 15 a 30 minutos, luego se somete a centrifugación y se elimina el sobrenadante;
b) el precipitado obtenido en la etapa (a) se suspende en una solución de lisozima (a una concentración de 2 mg/ml a 5 mg/ml) y lisostafina (a una concentración de 0,2 mg/ml a 0,5 mg/ml) en regulador PBS, la suspensión se agita en vórtice o se agita y se elimina el sobrenadante;
c) el material obtenido en la etapa (b) se somete a desintegración mecánica;
d) el material se incuba a una temperatura de 35 °C a 39 °C, desde 20 a 50 minutos; después de esto
e) se agrega una solución de NaOH o KOH (a una concentración de 0,65 mM a 0,8 mM), en una proporción de 1:1 a 1:3 en relación con el volumen del material de la etapa (c); el material se incuba a una temperatura de 80 °C a 95 °C, durante 5 a 10 minutos; la suspensión se centrifuga y el sobrenadante se elimina; se agrega un regulador que tiene un pH de aproximadamente 7,5, que contiene Tris-HCL, EDTA y ß-mercaptoetanol, y liticasa con la actividad enzimática de 30 U a 50 U; la muestra se incuba a una temperatura de 35 °C a 39 °C, desde 20 a 50 minutos; f) una suspensión se centrifuga y el sobrenadante se elimina;
g) el ADN microbiano se aísla del precipitado obtenido en la etapa (f).
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/PL2013/000109.
Solicitante: UNIWERSYTET JAGIELLONSKI.
Nacionalidad solicitante: Polonia.
Dirección: UL. GOLEBIA 24 31007 KRAKOW POLONIA.
Inventor/es: GOSIEWSKI,TOMASZ, BRZYCHCZY-WLOCH,MONIKA.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/10 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
PDF original: ES-2652267_T3.pdf
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