Identificación de ácidos nucleicos diana por escisión de sonda basada en estructura.

Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra,

que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra que comprende un ácido nucleico diana con

(i) un par de cebadores oligonucleotídicos, en el que un primer cebador oligonucleotídico comprende una secuencia complementaria de una región en una cadena de la secuencia de ácido nucleico diana y ceba la síntesis de un primer producto de extensión, y en la que un segundo cebador oligonucleotídico comprende una secuencia complementaria de una región en dicho primer producto de extensión y ceba la síntesis de una cadena de ácido nucleico complementaria de dicho primer producto de extensión, y

(ii) una sonda oligonucleotídica que comprende al menos dos partes distintas,

una primera parte comprende nucleótidos estándar con o sin análogos nucleotídicos que comprende una secuencia que es al menos parcialmente complementaria de una región de la secuencia de ácido nucleico diana en la que dicha primera parte hibrida dentro de la secuencia de ácido nucleico diana unida por dicho par de cebadores oligonucleotídicos, en la que la primera parte está bloqueada en el extremo 3' para prohibir la extensión por una polimerasa de ácido nucleico y para evitar la escisión por una exonucleasa en dirección 3' a 5'; y

una segunda parte unida al extremo 5' de la primera parte que comprende nucleótidos o no nucleótidos o tanto nucleótidos como no nucleótidos, y que comprende una secuencia que no es complementaria de la secuencia de ácido nucleico diana, en la que dicha segunda parte también comprende una modificación resistente a exonucleasas;

(b) amplificar dicha secuencia de ácido nucleico diana con una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa en dirección 5' a 3' en condiciones que permiten la hibridación de dicho par de cebadores oligonucleotídicos y dicha sonda oligonucleotídica con la secuencia de ácido nucleico diana y la síntesis de productos de extensión del cebador a partir de dicho par de cebadores oligonucleotídicos mientras que la actividad nucleasa en dirección 5' a 3' de dicha polimerasa de ácido nucleico es capaz de escindir y liberar de la sonda oligonucleotídica hibridada fragmentos que contienen la segunda parte de la sonda oligonucleotídica con o sin nucleótidos adicionales de la primera parte de la sonda oligonucleotídica;

(c) tratar dichos fragmentos que contienen la segunda parte de la sonda oligonucleotídica con una exonucleasa en dirección 3' a 5' que escinde dichos fragmentos hasta la modificación resistente a exonucleasas produciendo de este modo un fragmento que tiene un tamaño único de masa distinguible; y

(d) detectar la presencia o ausencia del fragmento único por espectrometría de masas, detectando de este modo la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico diana en la muestra.