Ensayo cuantitativo de amplificación y fusión multiplex de ácidos nucleicos.

Método para la amplificación por PCR en tiempo real, detección y cuantificación multiplex simultáneas de uno o más ácidos nucleicos diana en un único recipiente para muestras,

que comprende las etapas siguientes:

(a) poner en contacto una muestra, que se sospecha que contiene uno o más ácidos nucleicos diana, con por lo menos un juego de sondas oligonucleótidas, estando marcada cada sonda oligonucleótida en el juego con la misma o mismas fracciones informadoras, en el que cada una de dichas sondas oligonucleótidas marcadas

i. es suficientemente complementaria respecto a por lo menos una subsecuencia de por lo menos un ácido nucleico diana,

ii. es capaz de unirse al ácido nucleico diana correspondiente con una temperatura de fusión diferente de las temperaturas de fusión de las otras sondas oligonucleótidas marcadas en el mismo juego,

(b) amplificar los ácidos nucleicos diana en la muestra en un ciclo de una reacción de amplificación que incluye un intervalo de cambios de temperatura, en el que dichas sondas oligonucleótidas marcadas se disocia de los híbridos con los ácidos nucleicos diana correspondientes,

(c) detectar la emisión lumínica de dichas fracciones informadas en por lo menos una parte de dicho intervalo de cambio de temperatura, y

(d) representar la primera derivada de dicha emisión lumínica detectada en la etapa (c) en por lo menos dicha parte del intervalo de cambio de temperatura,

(e) determinar el valor del máximo de dicha derivada representada en la etapa (d),

(f) repetir las etapas (b) a (e) múltiples veces, y

(g) representar los valores de máximo de dicha derivada determinada en la etapa (e) frente al número de ciclos o el número de repeticiones de las etapas (b) a (e), y determinar el número de ciclos o el número de repeticiones a las que se alcanza un valor umbral predeterminado del valor determinado en la etapa (e),

cuantificando de esta manera la cantidad relativa de dicho ácido nucleico diana,

en el que dicha reacción de amplificación por PCR en tiempo real, detección y cuantificación multiplex simultáneas comprenden la detección de por lo menos dos secuencias diana diferentes, comprendiendo cualquier amplificación la utilización de parejas separadas de cebadores de amplificación para cada secuencia diana y la detección utilizando una sonda oligonucleótida separada para cada secuencia diana o la amplificación utilizando una pareja de cebadores de amplificación y la detección utilizando más de una sonda oligonucleótida para cada secuencia amplificada.