Variantes de la T7 ARN polimerasa con sustituciones de Cisteína-Serina.

Una solución acuosa en la que está ausente un agente reductor con un grupo tiol,

comprendiendo la solución acuosa un polipéptido, comprendiendo el polipéptido una variante de la T7 ARN polimerasa (variante de T7), teniendo la variante de T7 las propiedades de (i) actividad de ARN polimerasa dependiente de ADN, y (ii) una composición distinta de aminoácidos en comparación con el polipéptido de 883 aminoácidos de la T7 ARN polimerasa de SEC ID Nº: 2 (referencia de tipo silvestre),

en la que en una posición seleccionada de la 510 a la 530 de la variante de T7, numerada a partir del extremo N-terminal de la referencia de tipo silvestre, está presente un resto de Cisteína,

en la que la variante de T7 comprende una o más sustituciones de aminoácidos de las cuales una (o la primera) está en la posición 723 y donde la Serina sustituye al resto de Cisteína (Cys723Ser),

y en la que está ausente la formación de homomultímeros en la solución acuosa de la variante de T7 como resultado de uno o más enlaces disulfuro intermoleculares.

Variantes de la T7 ARN polimerasa con sustituciones de Cisteina-Serina

La invención pertenece a los campos de la biología molecular y la bioquímica de proteínas, particularmente al campo de la modificación de enzimas por ingeniería genética.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar a la persona experta variantes nuevas de la polimerasa de T7. Una variante de T7 de acuerdo con la invención incluye una sustitución de Cisteina-Serina en la posición 723 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de T7. Una variante de T7 de acuerdo con la invención tiene una actividad enzimática de ARN polimerasa dependiente del ADN y una tendencia reducida a formar homodímeros intermoleculares por medio de la oxidación de grupos tiol. Las sustituciones de aminoácidos identificadas de acuerdo con la invención parecen tener solamente un impacto mínimo, en caso de tenerlo, en la actividad de la ARN polimerasa del polipéptido de T7. Las mutaciones de la invención pueden combinarse opcionalmente incluso con mutaciones adicionales, incluyendo mutaciones que proporcionan termoestabilidad potenciada en comparación con la referencia de tipo silvestre.

La invención proporciona variantes mejoradas de la T7 ARN polimerasa mediante la introducción de mutaciones que reducen uno o más grupos tiol (= mercapto, = -SH, = sulfhidrilo) de la enzima mientras que se retiene la actividad enzimática. Particularmente, son ventajosas cualesquiera de las sustituciones de aminoácidos por Ser en cualquiera de las posiciones Cys125, Cys347, Cys492, Cys515, Cys723, Cys839 y combinaciones de las mismas.

Antecedentes de la invención

La T7 ARN polimerasa (E.C. 2.7.7.6.; también mencionada en el presente documento como "polimerasa T7" o "T7") es una ARN polimerasa monomérica codificada por ADN de bacteriófagos que cataliza la formación del ARN en la dirección 5-» 3. En el proceso de iniciación de la transcripción, T7 reconoce una secuencia promotora especifica, el promotor de T7. T7 consiste en 883 aminoácidos y tiene un peso molecular de 99 kDa. A nivel de la secuencia de aminoácidos, T7 es altamente homologa con respecto a la T3 ARN polimerasa y, en menor grado, con respecto a la SP6 ARN polimerasa. La estructura tridimensional de T7 es muy similar a otras polimerasas con distintas especificidades de molde y de sustrato, a pesar de la baja similitud de secuencia. T7 consiste en distintos dominios, el dominio N-terminal, el "pulgar", la "palma" y los "dedos" (Sousa, R., y Mukherjee, S., Prog. Nucí. Acid Res. Mol. Biol. 73 (2003) 1-41).

Se ha descrito la clonación y la expresión del gen que codifica T7 (Studier, et al., documento US 4.952.496). Se ha estudiado T7 de manera exhaustiva mediante mutagénesis para explorar los cambios conformacionales durante la transcripción (Ma, K., et. al., Proc. Nat. Acad. Sci. 102 (2005) 17612-17617), para facilitar el aclaramiento del promotor (Guillerez, J., ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. 102 (2005) 5958-5963) o para estudiar el fenómeno de ciclo abortivo (He, B, et al., J. Mol. Biol. 265 (1997) 275-288). Bonner, G., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25120-25128 describieron un conjunto de mutantes del sitio activo con tasas de elongación alteradas.

Debido a la especificidad del promotor y a la alta actividad enzimática de la ARN polimerasa, T7 es útil para una variedad de aplicaciones en biología molecular. En el campo de la expresión de proteínas recombinantes se usa T7 para la expresión de alto nivel de genes recombinantes en E. coli (Studier, F. W., y Moffat, B. A., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113-130). La síntesis de oligorribonucleótidos definidos se describió por Milligan, J. F., et al., Nucí. Aids Res. 15 (1987) 8783-8798.

La formación de enlaces disulfuro puede ocurrir durante o después de la síntesis de determinadas proteínas. Los enlaces disulfuro intramoleculares pueden contribuir significativamente a la estabilidad de las proteínas (Creighton, et al., Trends in Biotechnol. (1995) 13, 18-23). Pero la formación de enlaces disulfuro también ocurre entre distintas moléculas de proteínas. Para tal fin, los restos de cisterna implicados en este proceso deben localizarse en la superficie de la molécula de proteína y tienen que estar expuestos a disolvente. Adicionalmente, los restos de cisterna deben tener una geometría y una distancia entre ellos adecuada que facilite la formación de un enlace disulfuro.

A través de la formación de uno o más enlaces disulfuro intermoleculares entre proteínas, pueden generarse complejos proteicos di-, tri-, tetra-, penta- y multiméricos de grado más alto. Sin embargo, la formación no controlada y desfavorable de dichos complejos proteicos mediante enlaces disulfuro en condiciones artificiales (por ejemplo, en preparaciones purificadas de proteínas) puede tener un impacto en la actividad o funcionalidad biológica (por ejemplo, enzimática). Por lo tanto, se han hecho esfuerzos para mantener las proteínas en condiciones reductoras. Un método muy común es la adición de agentes reductores a los tampones de almacenamiento; los ejemplos de dichos agentes reductores son mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), ditioeritrol (DTE) y otros. Sin embargo, los agentes reductores de los grupos tiol tienen una vida útil limitada ya que ellos mismos se oxidan por el oxígeno molecular. Como consecuencia, los agentes reductores del tiol pierden su actividad protectora con el paso del tiempo, y puede tener lugar de nuevo la oxidación de los restos de cisteína junto con la formación de enlaces disulfuro.

Si una muestra de proteínas contiene una mezcla de distintos polipéptidos o si la muestra es un extracto en bruto, es posible que se formen multímeros entre moléculas de distintas especies proteicas (heteromultímeros). Si la mezcla contiene varios polipéptidos purificados de actividades definidas, la formación de heteromultímeros entre estas proteínas puede influir negativamente en dichas actividades, afectando a los polipéptidos individuales por separado o a todos los miembros de la muestra.

El polipéptido de la T7 ARN polimerasa contiene 12 cisternas, teniendo cada una tiol libre como grupo funcional (King, G. C., ef al., Biochemistry 25 (1986) 36-40).

Cuando los grupos tiole de dos restos de cisterna se acercan entre sí, una reacción de oxidación puede generar una unidad de cisterna con un enlace disulfuro (-S-S-). El almacenamiento de la T7 ARN polimerasa en ausencia de agentes reductores tiol da como resultado una actividad enzimática reducida. La reducción de la actividad se correlaciona con la formación de dímeros, trímeros e incluso multímeros de la enzima. La cinética de la formación de los enlaces disulfuro es fuertemente dependiente de parámetros como la concentración de proteínas, el tiempo de reacción, la temperatura y la presencia o ausencia de agentes oxidantes. Por lo tanto, en la práctica, el porcentaje de multímeros presentes en una muestra puede variar dependiendo del origen, la edad y la composición de la muestra. Incluso durante el procedimiento de purificación puede observarse algunas veces la formación de enlaces disulfuro.

En los multímeros de T7 tales como dímeros, trímeros o incluso multímeros de grado más alto, se cree que la razón de la actividad reducida de la polimerasa se debe a una accesibilidad reducida de los sitios activos. Además, una flexibilidad reducida de los esqueletos del polipéptido individual podía tener un impacto negativo en la función enzimática. Aunque la actividad de la polimerasa puede restaurarse mediante la adición de reactivos -SH de preparación reciente, se requiere el control continuo de la actividad residual de la enzima. Con el fin de salvaguardar y/o regenerar la actividad enzimática y/o proporcionar una preparación enzimática con una actividad de la polimerasa de T7 definida se necesita manipular adicionalmente el material con frecuencia (por ejemplo, retirar y analizar muestras, hacer que las preparaciones de T7 reaccionen con agentes reductores, etc.).

El DTNB [ácido 5,5-ditiob¡s-(2-nitrobenzoico), también conocido como reactivo de Ellman] es un agente químico que se usa para cuantificar el número o la concentración de grupos tiol en un polipéptido. Un grupo tiol reacciona con el DTNB, escindiendo el enlace disulfuro para producir 2-nitro-5-tiobenzoato (NTB"), el cual se ioniza al dianión NTB2' en agua a pH neutro y alcalino. El ion NTB2' tiene un color amarillo y puede determinarse, por ejemplo, espectrofotométricamente. La reacción de los grupos tiol y el DTNB es rápida y estequiométrica, liberando un mol de tiol un mol de NTB. Mukherjee, S., et al., Cell 110 (2002) 81-91 determinaron la reactividad de la T7 ARN polimerasa con DTNB. Para un polipéptido nativo de la enzima polimerasa de T7 de tipo... [Seguir leyendo]

1. Una solución acuosa en la que está ausente un agente reductor con un grupo tiol, comprendiendo la solución acuosa un pollpéptldo, comprendiendo el polipéptido una vahante de la T7 ARN polimerasa (vahante de T7), teniendo la vahante de T7 las propiedades de (I) actividad de ARN polimerasa dependiente de ADN, y (¡I) una composición distinta de aminoácidos en comparación con el polipéptido de 883 aminoácidos de la T7 ARN polimerasa de SEC ID N°: 2 (referencia de tipo silvestre),

en la que en una posición seleccionada de la 510 a la 530 de la variante de T7, numerada a partir del extremo N-terminal de la referencia de tipo silvestre, está presente un resto de Cisterna,

en la que la variante de T7 comprende una o más sustituciones de aminoácidos de las cuales una (o la primera) está en la posición 723 y donde la Serina sustituye al resto de Cisteína (Cys723Ser),

y en la que está ausente la formación de homomultímeros en la solución acuosa de la variante de T7 como resultado de uno o más enlaces disulfuro intermoleculares.

2. La solución acuosa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que en el polipéptido el número de aminoácidos sustituidos en la variante de T7 es de 1 a 10.

3. La solución acuosa de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el polipéptido de la variante de T7 además comprende una sustitución de Cisteína-Serina seleccionada del grupo que consiste en Cys125Ser, Cys347Ser, Cys492Ser, Cys515Ser y Cys839Ser.

4. La solución acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en la que el polipéptido de la variante de T7 además comprende una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Val426Leu, Val426lle, Val426Phe, Ser633Val, Ser633Met, Val650Leu, Thr654Leu, Ala702Val y Val795lle.

5. La solución acuosa de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el polipéptido de la variante de T7 comprende las sustituciones de aminoácidos Val426Leu, Val650Leu, Ala702Val y Val795lle.

6. La solución acuosa de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el polipéptido de la variante de T7 comprende las sustituciones de aminoácidos Val426Leu, Ala702Val y Val795lle.

7. La solución acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el polipéptido comprende la variante de T7 y un marcador His N-terminal.

8. La solución acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el polipéptido comprende la variante de T7 con una Metionina N-terminal.

9. Una solución acuosa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el agente reductor ausente con un grupo tiol se selecciona del grupo que consiste en mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol.

10. Un método para producir una solución acuosa con un polipéptido que comprende una variante de la T7 ARN polimerasa (variante de T7), teniendo la variante de T7 las propiedades de (i) actividad de ARN polimerasa dependiente de ADN, y (ii) una composición distinta de aminoácidos en comparación con el polipéptido de 883 aminoácidos de la T7 ARN polimerasa de SEC ID N°: 2 (referencia de tipo silvestre), en la que está ausente la formación de homomultímeros en la solución acuosa como un resultado de uno o más enlaces disulfuro intermoleculares, comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar la variante de T7 sustituyendo la Cys723 en la referencia de tipo silvestre, numerada a partir del extremo N-terminal por Serina (Cys723 Ser);

(b) opcionalmente incluir además en la variante de T7 una o más sustitución(es) de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en Cys125Ser, Cys347Ser, Cys492Ser, Cys515Sery Cys839Ser;

(c) opcionalmente incluir además en la variante de T7 una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en Val426Leu, Val426lle, Val426Phe, Ser633Val, Ser633Met, Val650Leu, Thr654Leu, Ala702Val y Val795lle;

(d) retrotranscribir la secuencia de aminoácidos del polipéptido, comprendiendo el polipéptido la variante de T7 obtenida en las etapas (a), (b) y (c), obteniendo de ese modo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido;

(e) expresar una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la etapa (d) en un sistema de expresión, y posteriormente purificar el pollpéptldo expresado a partir del sistema de expresión por medio de una cromatografía usando una fase móvil acuosa en la que está ausente un agente reductor con un grupo tiol;

obteniendo de ese modo una solución acuosa con el pollpéptldo que comprende la vahante de T7.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la solución acuosa obtenida en la etapa (e) se almacena en ausencia de un agente reductor con un grupo tiol.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11, en el que una cantidad de aproximadamente 1 pg a 3 pg de la proteína de la variante de T7 purificada de la solución acuosa está libre de un modo detectable de homomultímeros tal como se determina mediante electroforesis en SDS poliacrilamida y tinción del gel de electroforesis con el Kit Colorante Slmply Blue Safe de Invitrogen.

13. Un método para sintetizar una molécula de ARN, que comprende las etapas de

(a) proporcionar una solución acuosa con un polipéptido de la variante de la T7 ARN pollmerasa (variante de T7) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;

(b) proporcionar una molécula de ADN molde que comprende un promotor de T7, estando el promotor de T7

ligado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos diana para su transcripción;

(c) poner en contacto en la solución acuosa el ADN molde de la etapa (b) con la variante de T7 de la etapa (a) en presencia de ribonucleósidos trifosfato, formando de ese modo una mezcla de reacción;

(d) Incubar la mezcla de reacción en condiciones que permitan la actividad de la ARN pollmerasa;

sintetizando de ese modo la molécula de ARN.

14. Una mezcla de reacción que comprende una solución acuosa con un polipéptido de la variante de la T7 ARN polimerasa (variante de T7) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la solución

acuosa además comprende una molécula molde de ADN que comprende un promotor de T7 ligado funclonalmente a una secuencia de nucleótidos diana para la transcripción, y ribonucleósidos trifosfato.

15. Un kit que comprende, en envases separados, una solución acuosa con una variante del polipéptido de la T7 ARN pollmerasa (variante de T7) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un tampón con uno o

más ribonucleósidos trifosfato.