Vacuna recombinante para la rinitis infecciosa aviar y método para producirla.

Un proceso para preparar una vacuna recombinante de rinitis infecciosa aviar que comprende una etapa de construir un hospedador que puede producir como cuerpo de inclusión un péptido de fusión que consiste en un fragmento peptídico (Péptido A) derivado de la proteína HMTp210 de Avibacterium paragallinarum serotipo A y un fragmento peptídico (Péptido C) derivado de la proteína HMTp210 de Avibacterium paragallinarum serotipo C,

una etapa de cultivar dicho hospedador y de recoger y purificar una fracción del cuerpo de inclusión del cultivo, y una etapa de preparar una preparación que comprende dicha fracción purificada del cuerpo de inclusión, donde el péptido A y el péptido C consiste en 600 restos de aminoácidos o menos, donde el péptido A comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 35 mientras que el Péptido C comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 56.

Vacuna recombinante para la rinitis infecciosa aviar y método para producirla Campo técnico

La presente invención se refiere a una vacuna recombinante para la rinitis infecciosa aviar, y a un proceso para preparar la misma. Más en concreto, la presente invención se refiere a una vacuna recombinante para la rinitis infecciosa aviar que comprende como principio activo un péptido de fusión que consiste por una parte en una proteína de la membrana externa de Avibacterium paragallinarum (denominada también a partir de ahora en el presente documento como "A.pg") serotipo A y por otra de una protema de la membrana externa de A.pg serotipo C y un proceso para preparar la misma.

Antecedente de la técnica

La rinitis infecciosa aviar es una de las enfermedades respiratorias más importantes producidas por infección con A. pg. Las gallinas que padecen rinitis infecciosa aviar muestran síntomas principales de nariz congestionada, hinchazón de la cara y lagrimeo. La rinitis infecciosa aviar provoca un gran daño económico ya que ocasiona una disminución en la tasa de reproducción de las gallinas, retrasando la puesta de huevos, una disminución en la producción de huevos o fracaso en la puesta de huevos.

Page et al. clasificaron A.pg en tres serotipos A, B y C (véase por ejemplo la referencia no de patente 1) y Sawata et al. clasificaron A.pg en dos serotipos 1 and 2 (véase por ejemplo la referencia no de patente 2). A continuación, Kume et al. notificaron que el serotipo A de Page et al. corresponde al serotipo 1 de Sawata et al. y el serotipo C de Page et al. corresponde al serotipo 2 de Sawata et al. (véanse, por ejemplo, las referencias no de patente 3 y 4). En la actualidad se ha establecido que los agentes causantes principales de la rinitis infecciosa aviar son A.pg serotipo A (denominada también a partir de ahora en el presente documento "A.pg-A) y A.pg serotipo C (denominado también partir de ahora en el presente documento "A.pg-C").

En la prevención de la rinitis infecciosa aviar se ha usado ampliamente hasta la fecha una vacuna inactivada que se obtiene inactivando las células de A.pg-A o A.pg-C con formalina, timerosal y similares. Sin embargo, los efectos secundarios adversos producidos por dicha vacuna ¡nactivada suponen un problema ya que se ha notificado la formación de lesiones necróticas en la gallina inoculada cuando se administra la vacuna (véase, por ejemplo, la referencia no de patente 5). En las circunstancias que intentan desarrollar una vacuna segura, se ha investigado una vacuna recombinante que comprende un antígeno protector contra la infección preparada mediante una técnica de recombinación genética.

Por ejemplo, Tokunaga et al. aislaron e identificaron un gen que codificaba una proteína de la membrana externa de A.pg-A (gen de proteína de la membrana externa) y encontraron que el péptido obtenido expresando una parte de dicho gen (HPG3.5kbp, HPG4.1kbp) en E. coli era útil como antígeno protector contra la infección por rinitis infecciosa aviar. Además, utilizando dicho fragmento de ADN como sonda, obtuvieron un gen de una proteína de la membrana externa de A.pg-C y compararon las secuencias de nucleótidos del marco de lectura abierto del gen de la proteína de la membrana externa de A.pg y A.pg-C. Como resultado, desvelaron que ambas secuencias de nucleótidos tenían una homología de aproximadamente el 8 % en su conjunto, que una región de 34 kpb en el extremo 5' (denominada también a partir de ahora en el presente documento "Región 1") y una región de aproximadamente 1,2 kpb en el extremo 3' (denominada también a partir de ahora en el presente documento "Región 3") tenía una homología extremadamente elevada y una región de aproximadamente 1,5 kpb flanqueada por la Región 1 y la Región 3 (denominada también a partir de ahora en el presente documento "Región 2") tenía una homología baja (véase la referencia de patente 1).

Noro et al., han notificado también que la proteína de membrana externa descubierta por Tokunaga et al., es importante como antígeno protector de la rinitis infecciosa aviar. Noro et al., inmunizaron gallinas con péptidos codificados por fragmentos de ADN de 4.81 pb y 5.157 pb, que son partes del gen de una proteína de la membrana externa de A.pg-A, para demostrar que dichos péptidos pueden inducir anticuerpos Hl dirigidos contra A.pg-A y pueden tener un efecto vacuna (véase por ejemplo la referencia 2 de patente) y notificaron además que los péptidos codificados por fragmentos de ADN de aproximadamente 5,1 kpb y 5,5 kpb, que son partes del gen de la proteína de la membrana externa de A.pg-C, tenían una función y efecto similares (véase por ejemplo la referencia de patente 3).

Por otra parte, Yamamoto et al., emplearon un polipéptido codificado por un fragmento de ADN de 2.16 pb, que comprende la mayoría de los genes de la proteína de la membrana externa de A.pg-A que muestran la utilidad de dicho polipéptido (véase por ejemplo la referencia de patente 4) pero la secuencia de nucleótidos de aproximadamente 3 pb en el extremo 3' del fragmento de ADN notificado por los mismos fue completamente diferente de la mostrada por Tokunaga et al. y Noro et al.

Anteriormente se ha descrito el uso de un polipéptido de Haemophilus paragallinarum serotipo A de 13 kDa para encontrar un fragmento de H. paragallinarum serotipo C para su expresión en E. coli y su uso como vacuna (véase la referencia de patente 5).

Referencia de Patente 1: W98/12331

Referencia de Patente 2: Patente japonesa N° 41117

Referencia de Patente 3: JP 28-156317

Referencia de Patente 4: JP 24-5778

Referencia de patente 5: US 23/27987 A1

Referencia no de patente 1: Am. J. Vet. Res., 23:85-95, 1962

Referencia no de patente 2: Jpn. J. Vet. ScL, 4:645-652, 1978

Referencia no de patente 3: m. J. Vet. Res., 41:757-76, 198

Referencia no de patente 4: Am. J. Vet.Res., 41:191-194, 198

Referencia no de patente 5: Avian Dis., 15:19-117, 1971

Descripción de la invención

(Problema técnico que va a resolver la invención)

Tal como se ha descrito anteriormente, se ha desvelado que la proteína de la membrana externa o sus péptidos parciales procedentes de A.pg-A y A.pg-C, el agente causante principal de la rinitis infecciosa aviar, es útil como antígeno protector contra la rinitis infecciosa aviar. De esta manera, mezclando estos antígenos protectores contra la infección, puede realizarse eficazmente la inmunización de la rinitis infecciosa aviar. Sin embargo, una solución mediante mezcla simple necesita separar la producción de los dos antígenos infecciosos protectores y es costosa. En general, una vacuna para uso en un animal, a diferencia de una vacuna para uso en un ser humano, no sería aceptable para un ganadero a no ser que la vacuna no sea solamente de alta calidad sino que esté disponible a bajo coste. Por tanto, para una vacuna para uso en un animal, se desea un proceso para la producción con menor coste.

(Medios para resolver los problemas)

Los presentes inventores han investigado asiduamente para conseguir el objeto que se describe anteriormente, y como resultado, han desvelado que fragmentos peptídicos codificados por la secuencia de aproximadamente 1,6 kpb comprenden la Región 2 (la secuencia de nucleótidos de 3.639 pb a 5.162 pb de A.pg-A y la secuencia de nucleótidos de 4.247 pb a 5.758 pb de A.pg-C: véanse las Figs. 1 y 2) del gen de la proteína de la membrana externa de A.pg-A y A.pg-C (péptidos codificados por una secuencia de ADN de entre 3.558 pb a 5.192 pb de A.pg- A y por una secuencia de ADN de entre 4.166 pb a 5.788 pb de A.pg-C: denominado también a partir de ahora en el presente documento "AA5-1" y "CA5-1", respectivamente: véanse las Figs. 1 y 2) son útiles como útiles como antígenos protectores contra la rinitis infecciosa aviar, los presentes inventores han encontrado que un péptido de fusión (denominado también a partir de ahora en el presente documento "ACA5-1"), que se obtiene mediante unión conjunta a un fragmento de ADN que codifica AA5-1 y un fragmento de ADN que codifica CA5-1 y que expresa el fragmento de ADN resultante, mantuvo la inmunogenicidad de los respectivos antígenos incluso tras la fusión y el péptido de fusión presentó un efecto protector contra la infección de la rinitis infecciosa aviar equivalente a o superior al de AA5-1 o CA5-1, expresado cada uno de forma individual. Además, los presentes inventores han encontrado que CA5-1 se expresa en una fracción soluble cuando se expresa solo mientras que AA5-1 se expresa en una fracción insoluble formando un cuerpo de inclusión para completar de este modo la presente invención.

De acuerdo con ello, un objeto de la presente invención es proporcionar... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para preparar una vacuna recombinante de rinitis infecciosa aviar que comprende una etapa de construir un hospedador que puede producir como cuerpo de inclusión un péptido de fusión que consiste en un fragmento peptidico (Péptido A) derivado de la proteína HMTp21 de Avibacterium paragallinarum serotipo A y un fragmento peptidico (Péptido C) derivado de la proteína HMTp21 de Avibacterium paragallinarum serotipo C, una etapa de cultivar dicho hospedador y de recoger y purificar una fracción del cuerpo de inclusión del cultivo, y una etapa de preparar una preparación que comprende dicha fracción purificada del cuerpo de inclusión, donde el péptido A y el péptido C consiste en 6 restos de aminoácidos o menos, donde el péptido A comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N°: 35 mientras que el Péptido C comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N°: 56.

2. Una vacuna recombinante de rinitis infecciosa aviar que comprende como principio activo un péptido de fusión que consiste en un fragmento peptidico (Péptido A) derivado de la proteína HMTp21 de Avibacterium paragallinarum serotipo y un fragmento peptidico (Péptido C) derivado de la proteína HMTp21 de Avibacterium paragallinarum serotipo C, donde el péptido A y el péptido C consiste en 6 restos de aminoácidos o menos, donde el péptido A comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N°: 35 mientras que el Péptido C comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N°: 56.

3. El proceso de la reivindicación 1 o la vacuna de la reivindicación 2 donde el Péptido A tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N5: 1, 27, 28, 29, 3, 31, 32, 33, 34 y 35 mientras que el Péptido C tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los grupos que consiste en las SEC ID Nos: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 5, 51, 52, 53, 54, 55 y 56.

4. El proceso de la reivindicación 1 o 3 o la vacuna de la reivindicación 2 o 3 donde el Péptido A o el Péptido C comprende una secuencia de aminoácidos donde 1, 2, 3, 4, o 5 aminoácidos se eliminan, añaden o se sustituyen.

5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4 o la vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 donde la relación del péptido A y del péptido C en el péptido de fusión es de 1 a 3 del péptido C a 1 del péptido A.

6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5 o la vacuna de una cualquiera de las

reivindicaciones 2 a 5 donde el péptido de fusión comprende al menos una estructura donde el péptido C está unido

al extremo C del péptido A.

7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1, y 3 a 6 o la vacuna de una cualquiera de las

reivindicaciones 2 a 6 donde el péptido de fusión tiene un enlazador entre el péptido A y el péptido A, el Péptido C y

Péptido C, o el péptido A y el péptido C.

8. El proceso de la reivindicación 3 o la vacuna de la reivindicación 3 donde el péptido de fusión tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N"5: 8, 9, 1, 11, 12, 13, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 61, 62, 63, 64, 65, 66 y 67.

9. El proceso de la reivindicación 3 o la vacuna de la reivindicación 3 donde el péptido de fusión es cualquiera de (1) o (2) tal y como se indica a continuación:

(1) un péptido de fusión que consiste en una combinación del péptido A que consiste en una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N°: 1 y el péptido C que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°s: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 5, 51, 52, 53, 54 y 56;

(2) un péptido de fusión que consiste en una combinación del péptido A que consiste en una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N°: 3 y el péptido A que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°s: 1,27, 28, 29, 3, 31, 32, 33, 34 y 35.

1. El proceso de la reivindicación 9 o la vacuna de la reivindicación 9 donde el péptido de fusión tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nos: 43, 44, 46, 47 y 49.

11. El proceso de la reivindicación 9 o la vacuna de la reivindicación 9 donde el péptido de fusión tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 9 o 12.