Método y kit para detección de anticuerpo anti-Avibacterium paragallinarum.

Un método para la detección de un anticuerpo frente a serotipo A o serotipo C de Avibacterium paragallinarumcaracterizado por que dicho método comprende medición de anticuerpo sometiendo a reacción al menos unantígeno de péptido A o Péptido B más adelante con una muestra:

Péptido A:

que es un péptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, que consiste enuna cadena peptídica de 6 o más restos de aminoácidos y no incluye una secuencia de aminoácidos de losaminoácidos Nº 243-273 de SEC ID Nº: 1 donde dicho péptido detecta anticuerpos específicos de serotipo A;Péptido B:

que es un péptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, que consiste enuna cadena peptídica de 6 o más restos de aminoácidos y no incluye una secuencia de aminoácidos de losaminoácidos Nº 38-68 de SEC ID Nº: 2 donde dicho péptido detecta anticuerpos específicos de serotipo C.

Método y kit para detección de anticuerpo anti-Avibacterium paragallinarum

Campo técnico La presente invención se refiere a un método y a un kit para detectar un anticuerpo frente a Avibacterium paragallinarum. Específicamente, la presente invención se refiere a un método para detectar un anticuerpo frente a Avibacterium paragallinarum (denominado en lo sucesivo en el presente documento también “A.pg”; denominada previamente Haemophilus paragallinarum) que comprende detectar un anticuerpo inducido por una proteína de membrana exterior (denominada en lo sucesivo en el presente documento también “polipéptido p210 de HMT”) de serotipo A y/o serotipo C de Avibacterium paragallinarum mediante ELISA con una fase sólida a la cual se inmoviliza un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de región no homóloga de dicha proteína de membrana exterior o una parte de la misma y un kit de detección usado para dicho método. Aunque un péptido se denomina dipéptido, tripéptido, oligopéptido, polipéptido y similares dependiendo del número de restos de aminoácidos que constituyen dicho péptido, un péptido como se usa en el presente documento se define simplemente como “péptido” que abarca cualquiera de estos péptidos.

Antecedentes de la técnica La coriza infecciosa aviar causada por infección con A.pg se conoce como enfermedades respiratorias importantes en aves de corral. Las aves de corral que sufren de coriza infecciosa aviar tienen secreción nasal, hinchazón de la cara y epífora como síntomas cardinales. La coriza infecciosa aviar provoca un gran daño económico ya que conduce a la disminución de la tasa de reproducción de las aves de corral, retrasa la puesta de huevos, disminuye la producción de huevos o produce el fracaso de la puesta de huevos.

Page et al. clasificaron A.pg en tres serotipos A, B y C (Referencia no de patente 1) , mientras que Sawata et al. lo clasificaron en dos serotipos 1 y 2 (Referencia no de patente 2) . Posteriormente, Kume et al. indicaron que el serotipo A de Page corresponde al serotipo 1 de Sawata et al. mientras que el serotipo C de Page corresponde al serotipo 2 de Sawata et al. (Referencias no de patente 3 y 4) . Actualmente, el serotipo A (serotipo 1) de A.pg (denominado en lo sucesivo en el presente documento también “A.pg-A”) y el serotipo C (serotipo 2) de A.pg (denominado en lo sucesivo en el presente documento también “A.pg-C”) se consideran un agente causal principal de coriza infecciosa aviar.

Para la protección de coriza infecciosa aviar, se ha usado ampliamente hasta el momento una vacuna inactivada que se obtiene inactivando las células de A.pg-A o A.pg-C con formalina, timerosal y similares. Sin embargo, los efectos secundarios adversos provocados por tal vacuna inactivada han sido un problema ya que se han informado lesiones necróticas locales que se forman en los pollos inoculados cuando se administra la vacuna (Referencia no de patente 5) y, por lo tanto, existe un gran deseo del desarrollo de una vacuna altamente segura.

En estas circunstancias, se han desarrollado o están en desarrollo una vacuna de componente donde se usa únicamente un antígeno protector, es decir, un componente eficaz, obtenido a partir de células bacterianas o sobrenadante de cultivo; una vacuna recombinante donde un gen que codifica un antígeno protector se clona mediante una técnica de recombinación genética y se expresa en bacterias, levaduras, células animales, células de 45 planta, células de insecto y similares y se purifica y usa un producto expresado en una gran cantidad; y una vacuna de vector donde se inserta un gen que codifica un antígeno protector en un vector viral y similares.

Por ejemplo, Tokunaga et al. han purificado de forma satisfactoria, a partir de cultivo de A.pg-A, un polipéptido que tiene aproximadamente 130 kd de peso molecular a partir de dicho A.pg-A, induciendo dicho polipéptido a la producción de un anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (anticuerpo HI) y protegiendo frente a coriza infecciosa aviar por A.pg-A (Referencia de patente 1) . Además, han clonado un fragmento de ADN que codifica dicho polipéptido de 130 Kd y expresado dicho fragmento de gen en E. coli para encontrar que el polipéptido producido podría proteger de coriza infecciosa aviar provocada por serotipo A de Avibacterium paragallinarum. Además, han usado dicho fragmento de ADN que codifica el polipéptido de 130 Kd como una sonda para identificar 55 un gen p210 de HMT que codifica el polipéptido p210 de HMT de serotipo A, una proteína de membrana exterior que tiene una actividad de hemaglutinación, que consiste en 2042 aminoácidos. También han clonado a partir del serotipo C de Avibacterium paragallinarum un fragmento de ADN hibridable con dicho fragmento de ADN para obtener el gen p210 de HMT de serotipo C (Referencia de patente 2) . Ellos compararon las secuencias de nucleótidos de fase de lectura abierta de genes p210 de HMT de serotipos A y C de Avibacterium paragallinarum para informar que la homología entre ambos genes era de aproximadamente el 80% como un todo y que una región de aproximadamente 3, 4 kpb en el extremo 5’ (denominada en lo sucesivo en el presente documento “región 1”) y una región de aproximadamente 1, 2 kpb en el extremo 3’ (denominada en lo sucesivo en el presente documento “región 3”) tenían una homología muy elevada mientras que una región de aproximadamente 1, 5 kpb flanqueada por las dos regiones (denominada en lo sucesivo en el presente documento “región 2”) tenía una 65 homología baja (Referencia de patente 2) .

También se informó por Noro et al. que el gen p210 de HMT descubierto por Tokunaga et al. es importante para una región diana de una vacuna específica de serotipo. Noro et al. informaron que, mediante la inmunización de aves de corral con un péptido codificado por el fragmento de ADN desde 4801 pb hasta 5157 pb, que es una parte del gen p210 de HMT que codifica el polipéptido p210 de HMT de A.pg-A, dicho péptido inducía un anticuerpo HI y tenía un efecto de vacuna frente a A.pg-A (Referencia de patente 3) . Noro et al. también informaron en la 143ª Reunión de la Sociedad Japonesa de Ciencias Veterinarias celebrada el 3-5 de abril de 2007, en Japón que, mediante la inmunización de las aves de corral con un péptido codificado por un fragmento de ADN de 5, 5 kpb, que es una parte del gen p210 de HMT que codifica el polipéptido p210 de HMT de A.pg-C, dicho péptido inducía un anticuerpo HI y tenía un efecto de vacuna frente a A.pg-C.

El diagnóstico sérico no se ha llevado a cabo para coriza infecciosa aviar ya que, además del avance agudo de la enfermedad, las aves de corral infectadas con A.pg no son propensas a inducir un anticuerpo incluso después de la aparición de la enfermedad. Por otra parte, las aves de corral sometidas a vacunación inducen un anticuerpo frente a hemaglutinina (denominada en lo sucesivo en el presente documento también “HA”) en la superficie de las células de A.pg y, para la estimación del efecto de vacuna in vitro, se ha llevado a cabo un ensayo de inhibición de hemaglutinación (denominado en lo sucesivo en el presente documento también “ensayo HI”) con un anticuerpo anti-HA. El ensayo HI, donde se usan eritrocitos de pollo frescos o eritrocitos de pollo fijados con glutaraldehído, se indica que tiene defectos: (1) ya que los eritrocitos de pollo frescos son necesarios para la estimación del efecto de vacuna de A.pg-A, es problemático y requiere mucho trabajo tal como obtener pollos para sangre (criar y manejar pollos e condición de separación de los patógenos) , toma de muestras de sangre, tratamiento de la sangre y similares, (2) no es probable obtener resultados estables ya que los resultados pueden estar influidos por los lotes de eritrocitos de pollo y la estimación de un título de anticuerpo se realiza mediante la subjetividad de una persona que lo mide.

Por otra parte, Sun et al. indicaron, para diagnóstico sérico alternativo de ensayo HI, ELISA de bloqueo (B-ELISA) usando un anticuerpo monoclonal específico de serotipo (Referencia no de patente 6) . El B-ELISA es un ELISA donde se usaron células de serotipo A o C alteradas mediante sonicación como un antígeno y se usaron anticuerpos monoclonales reactivos con los serotipos respectivos para detectar de forma competitiva los anticuerpos en sueros. Este método es provechoso en el sentido de que tiene una sensibilidad mayor que el ensayo de HI y puede tratar múltiples anticuerpos. Sin embargo, requiere cuatro etapas, es decir, adición de suero, adición de anticuerpos monoclonales, adición de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con HRP y adición... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección de un anticuerpo frente a serotipo A o serotipo C de Avibacterium paragallinarum

caracterizado por que dicho método comprende medición de anticuerpo sometiendo a reacción al menos un 5 antígeno de péptido A o Péptido B más adelante con una muestra:

Péptido A: que es un péptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, que consiste en una cadena peptídica de 6 o más restos de aminoácidos y no incluye una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

24. 273 de SEC ID Nº: 1 donde dicho péptido detecta anticuerpos específicos de serotipo A; Péptido B: que es un péptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, que consiste en una cadena peptídica de 6 o más restos de aminoácidos y no incluye una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

3. 68 de SEC ID Nº: 2 donde dicho péptido detecta anticuerpos específicos de serotipo C.

2. Un kit para medición de un anticuerpo frente a serotipo A o serotipo C de Avibacterium paragallinarum caracterizado por que al menos uno de Péptido A o Péptido B más adelante se usa como un antígeno:

Péptido A:

que es un péptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, que consiste en una cadena peptídica de 6 o más restos de aminoácidos y no incluye una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

24. 273 de SEC ID Nº: 1 donde dicho péptido detecta anticuerpos específicos de serotipo A; Péptido B: que es un péptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, que consiste en una cadena peptídica de 6 o más restos de aminoácidos y no incluye una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

3. 68 de SEC ID Nº: 2 donde dicho péptido detecta anticuerpos específicos de serotipo C.

3. El método para detección de la reivindicación 1 o el kit para la medición de un anticuerpo de la reivindicación 2

donde el péptido A o el péptido B es una cadena peptídica de 10 o más restos de aminoácidos. 30

4. El método para detección de la reivindicación 1 o el kit para la medición de un anticuerpo de la reivindicación 2 donde el péptido A o el péptido B es una cadena peptídica de 20 o más restos de aminoácidos 5. El método para detección de la reivindicación 1 o el kit para la medición de un anticuerpo de la reivindicación 2 35 donde el Péptido A o Péptido B es una cadena peptídica como se indica a continuación:

Péptido A: que es un péptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos Nº 8-236 de SEC ID Nº: 1 y no incluye una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

24. 273 de SEC ID Nº: 1; Péptido B: que es un péptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

6. 452 de SEC ID Nº: 2 y no incluye una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

3. 68 de SEC ID Nº: 2;

6. El método para la detección de la reivindicación 1 o el kit para la medición de un anticuerpo de la reivindicación 2 donde el Péptido A o el Péptido B es una cadena peptídica como se indica a continuación:

Péptido A:

que es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos Nº 8-236 de SEC ID Nº: 1; Péptido B: que es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

6. 452 de SEC ID Nº:

2.

7. El método para la detección o el kit para la medición de un anticuerpo de la reivindicación 5 donde el Péptido A es una cadena peptídica como se indica a continuación:

Péptido A: que es un péptido que consiste en una parte de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, que comprende 60 una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

27. 445 de SEC ID Nº: 1 y no incluye una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

24. 273 de SEC ID Nº: 1.

8. El método para la detección o el kit para la medición de un anticuerpo de la reivindicación 6 donde el Péptido A es una cadena peptídica como se indica a continuación: 65

Péptido A: que es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.

27. 445 de SEC ID Nº:

1.

9. El método para la detección de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 8 o el kit para la medición de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 donde el Péptido A o el Péptido B es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos donde 1 o varios restos de aminoácidos en el mismo se han suprimido, añadido o sustituido, donde dicho péptido A detecta anticuerpos específicos de serotipo A y dicho péptido B detecta anticuerpos específicos de serotipo C.

10. El método para la detección de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 9 o el kit para la medición de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 donde la medición de anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en ELISA, transferencia de Western y transferencia puntual.

11. El método para la detección de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 10 o el kit para la medición de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, donde la muestra es sueros de pollos infectados con Avibacterium paragallinarum o sueros de pollos a los que se ha administrado una vacuna de Avibacterium paragallinarum.