Sistema de selección en un cultivo de células eucariotas basado en un gen receptor de folato unido a la membrana.

Un vector de expresión en eucariotas que comprende un primer polinucleótido que codifica un receptor funcional de folato unido a la membrana y un segundo polinucleótido que codifica un producto de interés,

en donde el producto de interés es un polipéptido farmacéutica o terapéuticamente activo o de diagnóstico.

Sistema de selección en un cultivo de células eucariotas basado en un gen receptor de folato unido a la membrana Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo sistema de selección para su uso en un proceso de cultivo de células eucariotas y para la expresión de un producto recombinante de interés. El sistema de selección se basa en la introducción de un gen receptor funcional de folato unido a la membrana exógeno junto con el polinucleótido o gen que codifica el producto de interés en células eucariotas y se puede utilizar ampliamente con células eucariotas para las que la viabilidad celular depende de la captación de ácido fólico.

Antecedente de la invención

Los marcadores de selección y los sistemas de selección se usan ampliamente en modificación genética, tecnología de ADN recombinante y producción de productos recombinantes, por ejemplo anticuerpos, hormonas y ácidos nucleicos, en cultivos celulares eucariotas. El objetivo principal de tales marcadores de selección y sistemas de selección dominantes es introducir un gen indicador que con la exposición a condiciones de cultivo selectivas proporciona células capaces de producir altos niveles de los productos recombinantes de interés.

Hasta la fecha, hay disponibles 3 sistemas principales de selección por marcador:

(a) El sistema glutamina sintasa: La enzima glutamina sintasa (GS) es responsable de la biosíntesis de glutamina a partir de glutamato y amoniaco. Esta reacción biosintética proporciona la única ruta para la formación de glutamina en células de mamífero. Por lo tanto, en ausencia de glutamina en el medio de cultivo, la enzima GS es esencial para la supervivencia de células de mamífero en cultivo. De manera importante, ciertas líneas celulares de mamífero que incluyen las células de mieloma de ratón carecen de la expresión de GS suficiente y por lo tanto no pueden sobrevivir sin glutamina añadida de manera exógena. Por lo tanto, tal línea celular es un receptor adecuado para un gen GS transfectado que en este sistema puede funcionar como un marcador indicador que permite a la células crecer en un medio que carece de glutamina. Por el contrario, las líneas celulares tal como las de células de ovario de hámster chino (CHO), que se utilizan ampliamente, expresan suficiente GS para mantener el crecimiento en un medio libre de glutamina. Por lo tanto, en estas células CHO que se van a utilizar como células receptoras del gen GS, se puede aplicar la sulfoximina metionina (MSX) un potente inhibidor específico de GS con el fin de inhibir la actividad de la GS endógena tal que solo puedan sobrevivir los transfectantes que expresan altos niveles del gen GS transfectado en un medio libre de glutamina. Una desventaja principal del sistema GS es el tiempo relativamente largo (es decir, 2-6 meses) de crecimiento selectivo con el fin de establecer células que sobre-expresen de manera estable el gen diana de interés. Otra desventaja es la utilización frecuente del agente citotóxico MSX para aumentar la presión selectiva. La presencia de tal agente citotóxico junto con el producto recombinante de interés (por ejemplo, un polipéptido como un anticuerpo) puede necesitar etapas de purificación adicionales para deshacerse de este agente citotóxico.

(b) El sistema de selección dihidrofolato reductasa/MTX: La dihidrofolato reductasa (DHFR) cataliza la reducción dependiente de NADP del ácido dihidrofólico en ácido tetrahidrofólico (THF). El THF se reconvierte entonces en 1-formil-THF y 5,1-metileno-THF que se utilizan en la biosíntesis de novo de purinas y timidato, respectivamente. El DHF es un subproducto de la actividad catalítica de la timidilato sintasa (TS) que cataliza la conversión de dUMP en dTMP en una reacción dependiente del 5,1-metileno-THF. Por lo tanto, la DHFR es crucial para el reciclaje de factores THF que son esenciales para la biosíntesis de nucleótidos purinas y pirimidinas que son necesarios para la replicación de ADN. Por lo tanto, se pueden utilizar células (por ejemplo, células CHO) que carecen del gen DHFR (es decir, por eliminación genómica dirigida) como receptores para la transfección del gen DHFR en un medio que está libre de nucleótidos. Tras la transfección, las células se pueden someter a un aumento gradual de concentraciones del antifolato MTX, un inhibidor de DHFR muy potente (Kd = 1 pM), forzando de esta manera la producción de niveles de DHFR aumentados. Con múltiples rondas de selección, el marcador indicador DHFR frecuentemente experimenta una amplificación genética significativa. Además, también se ha utilizado extensamente un ratón mutante DHFR con una importante resistencia al MTX como marcador indicador dominante que aumenta de manera importante la adquisición de altos niveles de resistencia a MTX en las células transfectantes. Una desventaja importante del sistema de selección DHFR/MTX es que esta técnica utiliza un agente citotóxico mutagénico, el MTX, que puede alterar fácilmente el genotipo de las células receptoras. Además puede que se tengan que tomar medidas de seguridad específicas para proteger las personas que manejan tales agentes. Esto da frecuentemente como resultado poblaciones celulares resistentes al MRX en las que no está presente la expresión del gen diana de interés debido a la pérdida de mutaciones funcionales en el portador de folato reducido (RFC) y/o pérdida de la expresión genética de RFC, que abolen ambas la captación de MTX. Otra desventaja es que el fármaco mutagénico puede contaminar fácilmente el producto diana sobre-expresado que se segrega (por ejemplo, un polipéptido como un anticuerpo) que está contenido en el medio de cultivo por lo que necesita una labor intensiva de métodos cromatográficos que consumen tiempo y son caros, necesarios para deshacerse de este compuesto mutagénico, el MTX. Además, la ausencia de MTX en el producto final tiene que demostrarse con sus respectivos ensayos.

(c) Sistema de selección por portador de folato reducido: El portador de folato (RFC) es una glucoproteína de membrana que se expresa de manera ubicua que sirve como el transportador más importante para la captación de folatos reducidos tales como el 5-metil-THF y el 5-formil-THF. Sin embargo el RFC presenta una afinidad muy pobre por el folato oxidado, el ácido fólico. Por lo tanto, las células que carecen de la expresión de RFC o se les ha eliminado el locus genómico RFC pueden servir como receptores para la transfección del gen marcador indicador RFC bajo condiciones en las que se ha privado gradualmente de folatos reducidos tales como el 5- formil-THF del medio de cultivo forzando de esta manera a las células a expresar niveles aumentados de este transportador de folato. Hay varias desventajas para el sistema de selección RFC: a) se deben utilizar células receptoras sin RFC en las que el locus RFC endógeno se haya anulado o inactivado por anulación dirigida o mutaciones de pérdida de función, b) el RFC tiene una afinidad extremadamente baja por el ácido fólico y por lo tanto este folato oxidado no se puede utilizar para la selección, c) Al contrario del sistema basado en el receptor de folato actual que es un sistema de captación de folato unidireccional y que se explicará en detalle posteriormente, el RFC es un trasportador de folato bi-direccional que presenta una importación y exportación de folatos igualmente potentes. Esto implica que bajo condiciones de privación de folato, la sobre-expresión de RFC puede ser perjudicial para las células receptoras que exporten más folato por medio del RFC sobreexpresado.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo sistema de selección metabólica que tiene ciertas ventajas sobre los sistemas de selección de la técnica anterior que se han mencionado anteriormente. El nuevo sistema de selección se basa en el uso de folatos en el medio de cultivo celular y en la presencia de receptores de folato que se introducen por medio de un vector de expresión en la célula eucariota recombinante que se pretende que produzca un producto de interés. Esta nueva estrategia no necesita la eliminación previa de un gen endógeno de receptor de folato (FR). Después de la introducción de un vector que alberga tanto el gen indicador FR así como el polinucleótido que codifica un producto de interés (como un polipéptido), las células se cultivan en un medio selectivo que contiene concentraciones altamente limitantes de folatos. Por lo tanto, solamente las células que sobre-expresan marcadamente FR pueden captar suficientes folatos para sostener el crecimiento celular, la replicación de ADN y la proliferación celular, permitiendo de esta manera la sobre-expresión del producto diana de interés.

El folato oxidado, es decir, el ácido fólico,... [Seguir leyendo]

1. Un vector de expresión en eucariotas que comprende un primer polinucleótido que codifica un receptor funcional de folato unido a la membrana y un segundo polinucleótido que codifica un producto de interés, en donde el producto de interés es un polipéptido farmacéutica o terapéuticamente activo o de diagnóstico.

2. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el receptor funcional de folato unido a la membrana codificado por el primer polinucleótido se selecciona de entre el grupo que consiste en un receptor de folato alfa (FRa), un receptor de folato beta (FR(3) y un mutante funcional de los mismos.

3. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el receptor funcional de folato unido a la membrana codificado por el primer polinucleótido es un receptor de folato alfa humano (hFRa).

4. Una célula eucariota para la que la viabilidad celular depende de la captación de folato, e introduciéndose en la célula eucariota de manera estable un primer polinucleótido localizado en un vector de expresión y que codifica un receptor funcional de folato unido a la membrana y un segundo polinucleótido localizado en un vector de expresión que codifica un producto de interés, en donde el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido están localizados en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión separados y en donde el producto de interés es un polipéptido farmacéutica o terapéuticamente activo o de diagnóstico.

5. La célula eucariota de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha célula carece de actividad completa de al menos un receptor funcional de folato unido a la membrana endógeno.

6. La célula eucariota de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde dicho primer polinucleótido que codifica un receptor funcional de folato unido a la membrana y dicho segundo polinucleótido que codifica un producto de interés se localizan en el mismo vector de expresión.

7. La célula eucariota de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el vector de expresión es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Un proceso de producción de una célula eucariota de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, comprendiendo dicho proceso proporcionar una célula eucariota para la que la viabilidad celular depende de la captación de folato, e introducir un primer polinucleótido localizado en un vector de expresión y que codifica el receptor funcional de folato unido a la membrana y un segundo polinucleótido localizado en un vector de expresión y que codifica el producto de interés, en donde el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido se localizan en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión separados.

9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el vector de expresión es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

1. Un método de selección de una célula eucariota capaz de expresar de manera estable un producto de interés codificado por un vector de expresión que se ha introducido en la célula, que comprende

(i) proporcionar una pluralidad de células eucariotas para las que la viabilidad celular depende de la captación de folato, e introduciéndose en las células un primer polinucleótido localizado en un vector de expresión y que codifica un receptor funcional de folato unido a la membrana y un segundo polinucleótido localizado en un vector de expresión y que codifica el producto de interés, en donde el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido están localizados en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión separados,

(ii) cultivar dicha pluralidad de células eucariotas en un medio de cultivo celular que tiene una concentración limitante de un folato, obteniendo de esta manera una célula eucariota en que se consigue la expresión estable del producto de interés.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además la identificación y el aislamiento de una célula eucariota en la que se consigue la expresión estable del producto de interés.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 11, en que la pluralidad de células eucariotas está compuesta de células eucariotas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

13. Un proceso para la producción de un producto de interés, que comprende

(i) llevar a cabo un método de selección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,

(ii) y aislar el producto de interés de dicho medio de cultivo celular o de dicha célula.

14. El uso de un receptor funcional de folato unido a la membrana que se introduce por medio de un vector de expresión como un marcador de selección para la selección de una célula eucariota, para la que la viabilidad celular de la célula eucariota depende de la captación de folato, y en donde la célula eucariota expresa de manera estable

un producto recombinante de interés, en donde el producto de interés es un polipéptido farmacéutica o terapéuticamente activo o de diagnóstico.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el receptor de folato se selecciona de entre el grupo que 5 consiste en el receptor de folato alfa (FRa), el receptor de folato beta (FR{f) y un mutante funcional de los mismos.