Sistema de placa de cultivo y procedimiento para la detección mejorada de microorganismos contaminantes de productos alimenticios.

Sistema de placas de cultivo para la detección de microorganismos contaminantes en productos alimenticios seleccionado del grupo que consiste en Lactobacillus,

Pediococcus, Pectinatus, Megasphaera, enterobacterias, Bacillus o Campylobacter, que comprende como entidades separadas:

(a) una placa de cultivo con un pH de 5,7 a 7,0 que contiene una base de nutrientes, 5 a 40 g/l de di-, oligo- o polisacárido, 5 a 30 g/l de CaCO3 en forma coloidal y un agente gelificante; y

(b) una solución madre de una enzima en una dilución conteniendo de 10 a 100 unidades/ml, en donde la enzima digiere un di-, oligo- o polisacárido en glucosa.

Sistema de placa de cultivo y procedimiento para la detección mejorada de microorganismos contaminantes de productos alimenticios [0001] La presente invención se refiere al enriquecimiento y detección de microorganismos contaminantes de productos alimenticios, especialmente bebidas y refrescos. Es particularmente adecuado para la detección de bacterias que deterioran la cerveza. La presente invención proporciona un sistema novedoso que a) mejora la recuperación de los microbios de descomposición, b) proporciona la detección más rápida y aparición más temprana de colonias en las placas, y c) proporciona tamaños de colonia mayores que hacen una detección más fácil. [0002] Puesto que las bacterias pueden propagarse en y contaminar los productos alimenticios después de que el producto haya pasado el control de calidad normal al final del proceso de producción y esté ya empaquetado, embotellado o enlatado, el deterioro por microorganismos (en su mayoría anaerobios) puede causar pérdidas económicas significativas. El material sospechoso debe ser retirado del mercado hasta que pueda confirmarse su naturaleza sin deteriorar. En el peor de los casos los costos de recogida de los alimentos en mal estado de las tiendas de alimentos pueden ser significativos. Además, la expedición de productos de mala calidad a los clientes puede fácilmente tener desventajas para la reputación del fabricante y la marca. Tan sólo una bacteria en un recipiente de alimentos o botella puede causar el deterioro del producto. Por lo tanto la presencia de incluso un bajo número de células bacterianas en un envase debe ser detectada. Esto se aplica particularmente a bebidas tales como cerveza. En general, la cerveza es un ambiente hostil para microbios diferentes de las levaduras debido a la presencia de compuestos antibacterianos de lúpulo y el etanol, condiciones anaerobias y un pH relativamente bajo. Sin embargo, algunos microorganismos pueden aún proliferar en la cerveza y deteriorar el producto al causar turbidez, acidez o producción de un olor desagradable (por ejemplo, a sulfuro de hidrógeno) . [0003] Los deterioradores de cerveza se identifican principalmente mediante procedimientos basados en la incubación en medios de cultivo. El medio de incubación puede ser líquido o sólido (por ejemplo placas de agar) . De acuerdo con una valoración realizada por Sartorius AG (Goettingen, Alemania) los cultivos nutrientes líquidos son generalmente mejores que los medios de cultivo sólidos, porque la invasión microbiana es inmediatamente visible por signo de fermentación. Especialmente organismos deteriorantes leves son más capaces de recuperarse y proliferar en cultivos líquidos que en placas de cultivo sólidos. Sin embargo, la detección microbiana exacta en cultivos líquidos lleva un tiempo considerablemente más largo (típicamente de 5 a 10 días) en comparación con cultivos en placa donde los resultados pueden ser a menudo obtenidos después de 2 a 3 días. Para el control microbiológico, se han aplicado también muchas técnicas biotecnológicas avanzadas, tales como el inmunoensayo y la cadena de reactiva de polimerasa (PCR) . Sin embargo, incluso para estos "métodos rápidos", pueden ser necesarios varios días de cultivo para alcanzar una cantidad de bacterias suficiente para una señal apreciable. No obstante, los procedimiento de placa de cultivo han mantenido su importante papel en el sistema de control de calidad microbiana en la industria de la producción alimenticia y fábricas de cerveza por las siguientes razones: 1) son fáciles y baratos de usar, 2) es posible cuantificar los microbios contaminantes, 3) puede ser detectados de manera simultánea varios microbios contaminantes, 4) es sencilla una mayor caracterización e identificación del microbio contaminante, ya que pueden obtenerse directamente "aislamientos puros" de la placa en forma de colonias bacterianas. En cerveceras se toman típicamente muestras a partir de tanques de fermentación, tanques de almacenamiento, superficies y tanques de sobre-presión. Muchos de estos emplazamientos son anaerobios, pero también puede existir una fuente de la contaminación en las superficies aeróbicas. Algunas especies estrictamente anaerobias también pueden sobrevivir en un ambiente que contiene oxígeno si están protegidas por bio-película o aisladas del oxígeno (por ejemplo, presentes en gotitas de líquido) . En consecuencia, las superficies en ambientes aeróbicos pueden servir como fuentes de contaminación de microbios anaeróbicos. Muchos de los contaminantes (anaeróbicos) son de crecimiento bastante lento. En los sistemas normales de control de calidad en fábricas de cerveza se detectan con tecnología de placas. Puesto que incluso una sola célula bacteriana puede causar contaminación del producto, las muestras se concentran a menudo en grandes volúmenes por filtración. En la práctica, las muestras de cerveza se filtran a través de un filtro de membrana que retiene los microorganismos presentes en la muestra. La membrana se retira entonces del filtro y se transfieren a una placa de cultivo. Sólo en muy pocos lugares existe la posibilidad de realizar el tratamiento de la muestra en condiciones completamente anaerobias. Si, sin embargo, las condiciones no son anaeróbicas, las bacterias de descomposición son sometidas a un estrés oxidativo severo que puede matarlas o dañarlas. Esto significa que, o bien no forman colonias en placas o su revitalización lleva más tiempo. Una célula dañada cuando se expone repentinamente a condiciones ricas en nutrientes puede morir. [0004] Los organismos anaerobios no toleran el oxígeno porque utilizan rutas metabólicas construidas alrededor de enzimas que reaccionan con oxidantes. Ellos también pierden los componentes clave presentes en organismos aeróbicos que puede desintoxicar el oxígeno: especialmente complejos de enzima de oxidasa y catalasa. Por lo tanto, con estos organismos es importante asegurar que el tiempo en que están expuestos a oxígeno perjudicial se reduce al mínimo. También su actividad metabólica durante la exposición al oxígeno debe mantenerse mínima. Desafortunadamente, el muestreo normal y la configuración del cultivo de placa se producen en condiciones que contienen oxígeno, y la generación de condiciones anaeróbicas en frascos anaerobios puede tardar varias horas. También debe observarse que incluso después de la eliminación del oxígeno del medio ambiente, la activación rápida de las células dañadas debido al entorno alto en nutrientes (especialmente alto contenido de azúcar de las placas de cultivo) puede favorecer dañarlos o matarlos. Estos problemas son generalmente difíciles de superar porque a fin de

facilitar el crecimiento rápido y la detección temprana (aparición de colonias) , el medio de cultivo debe proporcionar una alta cantidad de nutrientes. [0005] Organismos sensibles al oxígeno son típicamente cultivados en incubadoras anaerobias, cámaras anaerobias o bolsas anaerobias. Estos productos están disponibles en varios fabricantes tales como Oxoid, BD y Merck. Los productos químicos en tales sistemas anaeróbicos generan típicamente gas hidrógeno que reacciona rápidamente con el oxígeno generando agua. El hidrógeno se puede derivar, por ejemplo, de la reacción entre el borohidruro de sodio y agua. La reacción, por ejemplo, entre el ácido cítrico y bicarbonato de sodio puede generar tanto CO2 como hidrógeno. Se han lanzado diferentes variantes de tales sistemas, pero ninguno de ellos puede proporcionar condiciones anaeróbicas de manera inmediata. Se encuentran disponibles desde hace varios años sistemas que proporcionan condiciones completamente anaerobias para el tratamiento de muestras y cultivos, pero que se han aplicados tan sólo en algunas fábricas de cerveza. Por ejemplo, el Sistema de Atmósfera Controlada Modular (MACS) de Oxoid puede garantizar un ambiente óptimo para organismos anaerobios. En casos óptimos todos los pasos (muestreo, tratamiento de la muestra tal como filtración, placas) se van a realizar en condiciones anaeróbicas. Tales dispositivos raramente se encuentran disponibles para unidades de análisis de calidad estándar en la industria alimentaria. [0006] Incluso los microbios que, en principio, prefieren condiciones oxigénicas pueden sufrir estrés oxidativo cuando se exponen concentraciones de glucosa repentinamente cambiantes. Altas concentraciones de glucosa pueden inducir vías metabólicas (fermentativas) que resultan en la producción de compuestos inhibidores del crecimiento tales como el etanol, ácido acético y ácido láctico. [0007] De manera típica, las bacterias deteriorantes de los alimentos se cultivan en placas de medio que contienen un digesto enzimático de proteínas, extracto de carne, sales (como citrato de amonio, sulfato o cloruro de magnesio, fosfatos... [Seguir leyendo]

1. Sistema de placas de cultivo para la detección de microorganismos contaminantes en productos alimenticios 5 seleccionado del grupo que consiste en Lactobacillus, Pediococcus, Pectinatus, Megasphaera, enterobacterias, Bacillus

o Campylobacter, que comprende como entidades separadas:

(a) una placa de cultivo con un pH de 5, 7 a 7, 0 que contiene una base de nutrientes, 5 a 40 g/l de di-, oligo-o polisacárido, 5 a 30 g/l de CaCO3 en forma coloidal y un agente gelificante; y

(b) una solución madre de una enzima en una dilución conteniendo de 10 a 100 unidades/ml, en donde la enzima 10 digiere un di-, oligo-o polisacárido en glucosa.

2. Sistema de placa de cultivo de la reivindicación 1, en el que el producto alimenticio en una bebida.

3. Sistema de placa de cultivo de la reivindicación 2, en la que la bebida es cerveza. 15

4. Sistema de placa de cultivo de la reivindicación 3, en el que la placa de cultivo (a) contiene adicionalmente cerveza.

5. Sistema de placa de cultivo cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente gelificante es agar y/o

carragenina. 20

6. Sistema de placa de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polisacárido es almidón o un derivado de almidón.

7. Sistema de placa de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones reivindicación 1 a 6, en el que la enzima del 25 componente (b) es la glucoamilasa.

8. Sistema de placa de cultivo según la reivindicación 7, en el que la concentración de la glucoamilasa en la solución madre es 20 U/ml.

9. Sistema de placa de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el medio nutriente es un caldo de lactobacillus Man-Rogosa-Sharpe (MRS) .

10. Procedimiento para la detección en productos alimenticios de microorganismos contaminantes seleccionados de entre el grupo que comprende Lactobacillus, Pediococcus, Pectinatus, Megasphaera, enterobacterias, Bacillus o 35 Campylobacter, que comprende las siguientes etapas:

(A) preparar una solución coloidal de CaCO3 estéril con una concentración de 5 a 30 g/l de CaCO3;

(B) la preparación de un medio nutriente estéril que contiene nutrientes, 5 a 40 g/l de di-, oligo-o polisacárido y al menos un agente de gelificación en el que el pH del medio nutriente se ajusta dentro del intervalo de 5, 0 a 7, 0;

(C) mezclar (A) y (B) , 40 (D) ajustar el pH de 5, 7 a 7, 0,

(E) verter la composición resultante en placas de Petri,

(F) añadir una solución de enzima de división de di-, oligo-o polisacárido de una solución madre que contiene 10 a 100 unidades/ml de dicha enzima sobre la superficie del gel nutriente de la placa,

(G) la aplicación de una muestra de microorganismo y transferir la placa de cultivo a una incubadora e incubar la placa a 45 una temperatura apropiada hasta que en la placa aparezcan las colonias.

11. Procedimiento de la reivindicación 10, en el que la solución coloidal de CaCO3 contiene carragenina.

12. Procedimiento de la reivindicación 10 en el que el polisacárido es almidón o un derivado de almidón. 50

13. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la encima es glucoamilasa.