Reducción de toxicidad por interferencia de ARN desviada de su diana.

Un ácido nucleico que codifica un transcrito de miARN primario artificial (pri-miARN) que consiste en,

en orden de posición, una región flanqueante 5', una primera región de ARNip, una región de bucle, una segunda región de ARNip, y una región flanqueante 3', en el que la región flanqueante 5' comprende:

(a) una secuencia de unión 5' unida de forma contigua a la primera región de ARNip, en el que la secuencia de unión 5' consiste en 5-7 nucleótidos,

(b) una secuencia de abultamiento 5' posicionada cadena arriba de la secuencia de unión 5' que consiste en 1-10 nucleótidos, y

(c) una secuencia espaciadora 5' posicionada cadena arriba de la secuencia de abultamiento 5', en el que la secuencia espaciadora 5' es UGGUACCGUU (SEC ID Nº 180).

Reducción de toxicidad por interferencia de ARN desviada de su diana Prioridad de invención La presente solicitud de patente es una solicitud de continuación parcial de la solicitud de Estados Unidos Nº de serie 12/111.025 presentada el 28 de abril de 2008, que reivindica prioridad según 35 U.S.C. § 119 (e) a la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/914.309 presentada el 26 de abril de 2007. La presente solicitud de patente también reivindica prioridad según 35 U.S.C. § 119 (e) a la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/932.468 presentada el 31 de mayo de 2007, a la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 61/038.685 presentada el 21 de marzo de 2008, y a la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 61/070.622 presentada el 25 de marzo de 2008.

La presente solicitud reivindica el beneficio de todas las solicitudes enumeradas anteriormente.

Apoyo gubernamental Esta invención se hizo con el apoyo gubernamental según NS-50210, HD044093, DK-54759 y NS-592372 otorgado por el National Institutes of Health. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Antecedentes de la invención El ARN bicatenario (ARNbc) puede inducir silenciamiento génico post-transcripcional específico de secuencia en muchos organismos mediante un proceso conocido como interferencia de ARN (iARN) . Sin embargo, en células de mamífero, el ARNbc que es de 30 pares de bases o más largo puede inducir respuestas no específicas de secuencia que desencadenan una supresión de la síntesis de proteínas. La interferencia de la expresión génica por moléculas de iARN está ahora reconocida como una estrategia de origen natural para silenciar genes en las células de muchos organismos.

Las células pueden contener diversos ARNbc pequeños (-21-25 pb) . Dos tipos de moléculas de ARN pequeño tiene un efecto post-transcripcional: (1) moléculas de ARNip que inducen la degradación del ARNm, y (2) miARN, también llamados microARN, que inducen inhibición transcripcional. Otros ARN pequeños funcionan a nivel transcripcional afectando al ADN y la metilación de histonas. Las moléculas de iARN pueden generarse de forma exógena (por ejemplo, moléculas de ARNip) , e inducen silenciamiento génico transitorio. Como alternativa, pueden introducirse moléculas de iARN mediante un vector que expresa ARN horquilla corto (ARNhc) para mostrar silenciamiento génico persistente.

Stegmeier et al. (2005) muestran que ARNhc transcritos por polimerasa-II presentan silenciamiento eficaz de expresión génica cuando el ARNhc se incluye en un contexto de microARN (Stegmeier et al., 2005, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 102 (37) : 13212-13217) .

Silva et al. (2005) presentan la construcción y validación de bibliotecas de expresión de ARNhc de segunda generación diseñadas usando un conocimiento aumentado de la bioquímica de interferencia de ARN (Silva et al., 2005, Nature Genetics 37 (11) : 1281-1288) .

El documento WO 2008/134646 A se refiere a moléculas de iARN dirigidas contra una secuencia de ácido nucleico que codifica enfermedades por repetición de poliglutamina, y métodos para usar estas moléculas de iARN.

El documento WO 2005/081714 A2 proporciona células y animales, así como métodos para producir células y animales, que expresan al menos una molécula de ARN interferente para regular la expresión de un gen o familia de genes específicos.

Sumario de la invención Se describe en este documento un vector lanzadera de miARN aislado que expresa un ARNip terapéutico con toxicidad limitada desviada de su diana. La inclusión de un ARNip que muestra toxicidad desviada de su diana en el contexto de un vector lanzadera de ARNhc dentro de los vectores lanzadera de miARN descritos en este documento limita la toxicidad desviada de su diana del ARNip. También se describe en este documento un vector lanzadera de miARN que expresa un ARNip terapéutico en el cerebro con toxicidad limitada desviada de su diana. Se describe en este documento un vector lanzadera de miARN que expresa un ARNip terapéutico en el cuerpo estriado con toxicidad limitada desviada de su diana. Descrito adicionalmente en este documento, el vector lanzadera de miARN expresa un ARNip terapéutico en el cerebro con toxicidad limitada desviada de su diana. La presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica un trascrito de miARN primario (pri-miARN) que consiste en, en orden de posición, una región flanqueante 5', una primera región de ARNip, una región de bucle, una segunda región de ARNip, y una región flanqueante 3', donde la región flanqueante 5' comprende: (a) una secuencia de unión 5' unida de forma contigua a la primera región de ARNip, donde la secuencia de unión 5' consiste en 5-7 nucleótidos, (b) una

secuencia de abultamiento 5' posicionada cadena arriba de la secuencia de unión 5' que consiste en 1-10 nucleótidos, y (c) una secuencia espaciadora 5' posicionada cadena arriba de la secuencia de abultamiento 5', donde la secuencia espaciadora 5' es UGGUACCGUU (SEC ID Nº 180) . En ciertas realizaciones, la primera región de ARNip es una región no de guía y la segunda región de ARNip es una región de guía, y en otras realizaciones la primera región de ARNip es una región de guía y la segunda región de ARNip es una región no de guía. Como se usa en este documento, la expresión "región de guía de ARNip" es una secuencia monocatenaria de ARN que es complementaria a una secuencia diana. Como se usa en este documento, la expresión "región no de guía de ARNip" es una secuencia monocatenaria de ARN que es complementaria a la "región de guía de ARNip". Por tanto, en las condiciones apropiadas, la región de guía de ARNip y la región no de guía de ARNip se asocian para formar un dúplex de ARN. Como se usa en este documento, todas las secuencias de ácido nucleico se enumeran, como es habitual, en una dirección 5' a 3'.

En ciertas realizaciones, la primera región de ARNip es de aproximadamente 20-30 nucleótidos de longitud, y es aproximadamente un 70-100% complementaria a la segunda región de ARNip, que también es de aproximadamente 20-30 nucleótidos de longitud.

La región flanqueante 5' contiene una secuencia de unión 5' unida de forma contigua a la primera región de ARNip (Fig. 20B y 20C) . Como se usa en este documento, la expresión "sitio de unión" o una "secuencia de unión" es una corta secuencia de ácido nucleico de menos de 60 nucleótidos que conecta otras dos secuencias de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, el sitio de unión es de una longitud de cualquier número entero entre 4 y 50, inclusivos. La secuencia de unión 5' consiste en 5-7 nucleótidos (por ejemplo, consiste en 6 nucleótidos) . En ciertas realizaciones, la secuencia de unión 5' codifica GUGASSS, donde S es un nucleótido G o C (es decir, la secuencia de unión 5' codifica UGACCC, UGACCG, UGACGC, UGAGCC, UGACGG, UGAGGC, UGAGCG, o UGAGGG) . En ciertas realizaciones, la secuencia de unión 5' codifica GUGAGCG.

La región flanqueante 5' comprende adicionalmente una secuencia de abultamiento 5' posicionada cadena arriba de la secuencia de unión 5'. Como se usa en este documento, la expresión "secuencia de abultamiento" es una región de ácido nucleico que es no complementaria al ácido nucleico opuesto al mismo en un dúplex. Por ejemplo, un dúplex contendrá una región de ácidos nucleicos complementarios, después una región de ácidos nucleicos no complementarios, seguida por una segunda región de ácidos nucleicos complementarios. Las regiones de ácidos nucleicos complementarios se unirán entre sí, mientras que la región no complementaria central no se unirá, formando de ese modo un "abultamiento". En ciertas realizaciones, las dos hebras de ácido nucleico posicionada entre las dos regiones complementarias serán de diferentes longitudes, formando de ese modo un "abultamiento". La secuencia de abultamiento 5' consiste en aproximadamente 1-10 nucleótidos. En ciertas realizaciones, la secuencia de abultamiento 5' codifica UAAACUCGA. En ciertas realizaciones, la secuencia de abultamiento 5' tiene un 0-50% de complementariedad a la secuencia de abultamiento 3'. El sitio de restricción XhoI es CTCGAG (con "T" siendo "U" en forma de ARN en esta y todas las demás secuencias enumeradas en este documento) .

La región flanqueante 5' contiene adicionalmente una secuencia espaciadora 5' posicionada cadena arriba de la secuencia de abultamiento 5'. En ciertas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' consiste en 9-12 nucleótidos, tal como 10-12 nucleótidos. En ciertas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' tiene un 60-100% de complementariedad con una secuencia espaciadora 3'. La secuencia de abultamiento 5' comprende un sitio de clonación, tal como... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico que codifica un transcrito de miARN primario artificial (pri-miARN) que consiste en, en orden de posición, una región flanqueante 5', una primera región de ARNip, una región de bucle, una segunda región de 5 ARNip, y una región flanqueante 3', en el que la región flanqueante 5' comprende:

(a) una secuencia de unión 5' unida de forma contigua a la primera región de ARNip, en el que la secuencia de unión 5' consiste en 5-7 nucleótidos, (b) una secuencia de abultamiento 5' posicionada cadena arriba de la secuencia de unión 5' que consiste en 1-10 10 nucleótidos, y (c) una secuencia espaciadora 5' posicionada cadena arriba de la secuencia de abultamiento 5', en el que la secuencia espaciadora 5' es UGGUACCGUU (SEC ID Nº 180) .

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que la secuencia de unión 5' codifica GUGASSS, en el que S es un 15 nucleótido G o C, preferiblemente en el que la secuencia de unión 5' codifica GUGAGCG.

3. El ácido nucleico de la reivindicación 2, en el que la secuencia de abultamiento 5' comprende un sitio de clonación, preferiblemente en el que el sitio de clonación codifica un sitio XhoI.

4. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que la región flanqueante 5' comprende adicionalmente una secuencia cadena arriba 5' posicionada cadena arriba de la secuencia espaciadora 5', preferiblemente en el que la secuencia cadena arriba 5' es de aproximadament.

3. 2000 nucleótidos de longitud.

5. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la región flanqueante 3' comprende una secuencia de unión 3' que se une de forma contigua a la segunda región de ARNip, preferiblemente en el que la secuencia de unión 3' consiste en 5-7 nucleótidos, preferiblemente en el que la secuencia de unión 3' es al menos aproximadamente un 85% complementaria a la secuencia de unión 5', preferiblemente en el que la secuencia de unión 3' codifica CGCYUAC, en el que Y es C o U, preferiblemente en el que la secuencia de unión 3' codifica CGCCUAC.

6. El ácido nucleico de la reivindicación 5, en el que la región flanqueante 3' comprende adicionalmente una secuencia de abultamiento 3' posicionada cadena abajo de la secuencia de unión 3', preferiblemente en el que la secuencia de abultamiento 3' comprende un sitio de clonación, preferiblemente en el que el sitio de clonación codifica un sitio SpeI/XbaI o un sitio SpeI.

7. El ácido nucleico de la reivindicación 2, en el que la secuencia de abultamiento 5' codifica UAAACUCGA.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 6, en el que la secuencia de abultamiento 3' consiste en aproximadamente 1

nucleótidos, preferiblemente en el que la secuencia de abultamiento 3' codifica UAG. 40

9. El ácido nucleico de la reivindicación 6 o 8, en el que la secuencia de abultamiento 5' es complementaria a la secuencia de abultamiento 3' en solamente un nucleótido en cada extremo de la secuencia de abultamiento.

10. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 6, 8 o 9, en el que la región flanqueante 3' comprende

adicionalmente una secuencia espaciadora 3' posicionada cadena abajo de la secuencia de abultamiento 3', preferiblemente en el que la secuencia espaciadora 3' consiste en 10-12 nucleótidos, preferiblemente en el que la secuencia espaciadora 3' es AGCGGCCGCCA, preferiblemente en el que la secuencia espaciadora 3' es al menos aproximadamente un 70% complementaria a la secuencia espaciadora 5'.

11. El ácido nucleico de la reivindicación 10, en el que la región flanqueante 3' comprende adicionalmente una secuencia cadena abajo 3' posicionada cadena abajo de la secuencia espaciadora 3', preferiblemente en el que la secuencia cadena arriba 5' no aparea significativamente con la secuencia cadena abajo 3', preferiblemente en el que la secuencia cadena abajo 3' es de aproximadament.

3. 2000 nucleótidos de longitud.

12. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la región de bucle es de 15-19 nucleótidos de longitud, preferiblemente en el que la región de bucle es de 17 nucleótidos de longitud.

13. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la región de bucle codifica CUNNNNNNNNNNNNNNNGG o CCNNNNNNNNNNNNNNNGG, preferiblemente en el que la región de bucle 60 codifica CUGUGAAGCCACAGAUGGG o CCGUGAAGCCACAGAUGGG.

14. Un ARN codificado por el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

15. Un casete de expresión que comprende un promotor unido de forma contigua al ácido nucleico de una 65 cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

16. Un vector que comprende el casete de expresión de la reivindicación 15.

17. El vector de la reivindicación 16, en el que el vector es un vector de virus adeno-asociado (AAV) .

18. Un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, el casete de expresión de la reivindicación 15, el vector de la reivindicación 16 o 17 para uso en terapia que provoca interferencia de ARN de baja toxicidad.

19. Un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, el casete de expresión de la reivindicación 15, el vector de la reivindicación 16 o 17 para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa. 10