Oligonucleótidos inmunoestimuladores.

Un oligonucleótido inmunoestimulador sintético, de uso como medicamento,

que contiene al menos un dinucleótdo CpG no metilado, en el que el oligonucleótido es un fosfodiéster, no contiene un palíndrome de seis bases e incluye más de ocho pero no más de 100 nucleótidos.

Oligonucleótidos inmunoestimuladores

Apoyo gubernamental

El trabajo que ha producido esta invención fue apoyado en parte por el National Institute of Health Concesión N° R29-AR42556-01. El gobierno de los EE. UU. puede tener por tanto ciertos derechos en la invención.

Fundamento de la invención

AON se une a membrana celular V se internaliza

En lo años 70, varios investigadores informaron de la unión de ADN de alto peso molecular a membranas celulares (Lerner, RA, W. Meinke y DA Goldstein. 1971. "Membrane-associated DNA in the cytoplasm of diploid human Iymphocites". Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 68:1212; Agrawal, S.K., R.W Wagner, P.K. McAllister y B. Rosenberg. 1975. "Cell-surface-associated nucleic acid in tumorigenic cells made visible with platinum-pyrimidine complexes by electron microscopy". Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 72:928) . En 1985, Bennett et al. presentaron la primera evidencia de que la unión de ADN a linfocitos es similar a una interacción ligando receptor: la unión es saturable, competitiva y conduce a endocitosis y degradación de ADN (Bennett, R.M., G.T. Gabor y M.M. Merritt. 1985. "DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of DNA". J. Clin. Invest.76:2182) . Al igual que el ADN, los oligodesoxirribonucleótidos (ODNs) son capaces de entrar en células de una manera saturable, independiente de la secuencia y dependiente de la temperatura y la energía (examinado en Jaroszewski, J.W. y J.S. Cohen. 1991. "Cellular uptake of antisense oligodeoxynucleotides". Advanced Orug Oeliver y Reviews 6:235; Akhtar, S., Y. Shoji y R.L. Juliano. 1992. "Pharmaceutical aspects of the biological stability and membrane transport characteristics of antisense oligonucleotides". En: Gene Regulation: Biology of Antisense RNA y DNA. R.P. Erickson y J.G. Izant, reds. Raven Press Ud. Nueva York, págs. 133; y Zhao, Q., T. Waldschmidt, E. Fisher, C.J. Herrera y A.M. Krieg, 1994. "Stage specific oligonucleotide uptake in murine bone marrow B cell precursors". Blood, 84:3660) . No se ha clonado todavía un receptor para absorción de ADN u ODN, y no está claro aún si la unión de ODN y la absorción celular tienen lugar a través del mismo mecanismo o uno diferente del de ADN de alto peso molecular.

Se ha mostrado que la absorción de ODN de linfocitos está regulada por activación celular. Las células del bazo estimuladas con el mitógeno de células B LPS ha aumentado drásticamente la absorción de ODN en la población de células B, mientras que las células del bazo tratadas con el mitógeno de células T Con A mostraron una absorción de ODN aumentada por células T pero no B (Krieg, A.M., F. Gmelig-Meyling, M.F. Gourley, WJ. Kisch, LA Chrisey y A.D. Steinberg. 1991. "Uptake of oligodeoxyribonucleotides by Iymphoid cells is heterogeneous and inducible".

Antisense Research and Oeve/opment 1 :161) .

Efectos inmunes de ácidos nucleicos

Se han evaluado extensamente varios polinucleótidos como modificadores de la respuesta biológica. Quizás el mejor ejemplo es poli (I, C) , que es un inductor eficaz de la producción de IFN así como un activador de macrófagos e inductor de la actividad de NK (Talmadge, J.E., J. Adams, H. Phillips, M. Collins, B. Lenz, M. Schneider, E. Schlick,

R. Ruffmann, R.H. Wiltrout y MA Chirigos. 1985. "Immunomodulator y effects in mice of polynosinic-polycytidylic acid complexed with poly-L-:-Iysine and carboxymethylcellulose". Cancer Res. 45:1058; Wiltrout, R.H., R.R. Salup, TA Twilley y J. E. Talmadge. 1985. "Immunomodulation of natural killer activity by polyribonucleotides". J. Biol. Resp. Mod. 4:512; Krown, S.E. 1986. "Interferons and interferon inducers in cancertreatment". Sem. Oncol. 13:207; y Ewel, C.H., S.J. Urba, WC. Kopp, J.W Smith 11, R.G. Steis, J.L. Rossio, D.L. Longo, M.J. Jones, WG. Alvord, C.M. Pinsky,

J.M. Beveridge, K.L. McNitt y S.P. Creekmore. 1992. "Polynosinic-polycytidylic acid complexed with poly-L-Iysine and carboxymethylcellulose in combination with interleukin 2 in patients with cancer: clinical and immunological effects". Canco Res. 52:3005) . Parece que esta activación de NK de ratón puede ser debida únicamente a inducción de la secreción de IFN ~ (Ishikawa, R. y CA Biron. 1993. "IFN induction and associated changes in splenic leukocyte distribution". J. Immunol. 150:3713) . Esta activación fue específica para el azúcar ribosa porque la desoxirribosa fue ineficaz. Su eficaz actividad antitumores in vitro condujo a varias pruebas clínicas usando poli (I, C) acomplejado con poli-L-lisina y carboximetilcelulosa (para reducir la degradación por ARNsa) (Talmadge, J.E. et al., 1985, citado antes; Wiltrout, R.H. et al., 1985, citado antes) ; Krown, S.E., 1986, citado antes) ; y Ewel, C.H. et al., 1992, citado antes) . Desgraciadamente, los efectos secundarios tóxicos han impedido así mucho a poli (I, C) convertirse en un agente terapéutico útil.

Los ribonucleótidos de guanina sustituidos en posición C8 con un grupo bromo o tiol son mitógenos de células B y pueden sustituir a "factores de diferenciación de células B" (Feldbush, T.L. y Z.K. Bailas. 1985. "Lymphokine-like activity of 8-marcaptoguanosine: induction of T and B cell differentiation". J. Immunol. 134:3204; y Goodman, M.G. 1986. "Mechanism of synergy between T cell signals and C8-substituted guanine nucleosides in humoral immunity: B Iymphotropic cytokines induce responsiveness to 8-mercaptoguanosine". J. Immunol. 136:3335) . Las 8marcaptoguanisina y 8-bromoguanosina también pueden sustituir el requisito de citoquina para la generación de CTL restringida por MHC (Feldbush, T.L., 1985, citado antes) , aumentar la actividad de NK de ratón (Koo, G.C., M.E. Jewell, C.L. Manyak, N.H. Sigal y L.S. Wicker, 1988. "Activation of murine natural killer cells and macrophages by 8

bromoguanosine". J. Immunol. 140;3249) y tener sinergia con IL-2 para inducir la generación de LAK de ratón (Thompson, RA y Z.K. Bailas. 1990. "Lymphokine-activated killer (LAK) cells. V. 8-Mercaptoguanosine as an IL-2sparing agent in LAK generation". J. Immunol. 145:3524) . Las actividades de aumento de NK y LAK de estas guanosinas C8-sustituidas parecen ser debidas a su inducción de IFN (Thompson, RA et al. 1990, citado antes) . Recientemente, se encontró que una timidina 5'-trifosforilada producida por una micobacteria era mitogénica para un subgrupo de células yó T humanas (Constant, P., F. Oavodeau, M. A Peyrat, Y. Poquet, G. Puzo, M. Bonneville y J.

J. Fournie. 1994. "Stimulation of human yó T cells by nonpeptidic mycobacterial ligands" Science 264:267) . Este informe indicaba la posibilidad de que el sistema inmune pueda tener formas evolucionadas para responder preferentemente a ácidos nucleicos microbianos.

Varias observaciones sugieren que ciertas estructuras de AON pueden tener también el potencial de activar linfocitos. Por ejemplo, Bell et al. informaban de que complejos de proteína-AON nucleosómicos (pero no AON desprovisto) en sobrenadantes de células de bazo causaban proliferación de células B y secreción de inmunoglobulina (Bell, DA, B. Morrison y P. VandenBygaart. 1990. "Immunogenic ONA-related factors". J. Clin. Invest. 85:1487) . En otros casos, se ha informado de que AON desprovisto tiene efectos inmunes. Por ejemplo, Messina et al. han informado recientemente de que fragmentos de 260 a 800 pb de poli (dG) e (dC) y poli (dGedC) eran mitogénicos para células B (Messina, J.P., G.S. Gilkeson y O.S. Pisetsky. 1993. "The influence of ONA structure on the in vitro stimulation of murine Iymphocytes by natural and synthetic polynucleotide antigens". Cel/. Immun 01. 147:148) . Tokunaga et al. han informado de que dGedC induce actividad de y-IFN y NK (Tokunaga, S. Yamamoto y

K. Namba. 1988. "A synthetic single-stranded ONA, poly (dG, dC) , induces interferon-a/~ and -y, augments natural killer activity, and suppresses tumor growth" Jpn. J. Cancer Res. 79:682) . Aparte de tales secuencias de homopolímeros artificiales, Pisetsky et al. informaban de que AON de mamífero puro no tiene efectos inmunes detectables, pero que AON de ciertas bacterias induce activación de células B y secreción de inmunoglobulina (Messina, J.P., G.S. Gilkeson y O.S. Pisetsky. 1991. "Stimulation of in vitro murine Iymphocyte proliferation by bacterial ONA". J. Immunol. 147:1759) . Suponiendo que estos datos no resultan de algún contaminante inusual, estos estudios sugerían que una estructura particular u otra característica de AON bacteriano lo hace capaz de provocar la activación de células... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido inmunoestimulador sintético, de uso como medicamento, que contiene al menos un dinucleótdo CpG no metilado, en el que el oligonucleótido es un fosfodiéster, no contiene un palíndrome de seis bases e incluye más de ocho pero no más de 40 nucleótidos.

2. Un oligonucleótido inmunoestimulador según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido tiene un efecto mitogénico en linfocitos de vertebrados.

3. Un oligonucleótido inmunoestimulador según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que contiene una secuencia representada por la siguiente fórmula:

en la que C y G son no metilados, X1, X2, X3 y X4 son nucleótidos y no está presente una secuencia de trinucleótido GCG en o cerca de los términos 5' y 3'.

4. Un oligonucleótido inmunoestimulador según la reivindicación 3, en el que X1X2 es un dinucleótido GpA.

5. Un oligonucleótido inmunoestimulador según la reivindicación 3, en el que X3X4 es un dinucleótido TpC o TpT.

6. Un oligonucleótido inmunoestimulador según las reivindicaciones 3, 4 o 5, en el que la secuencia está representada por la siguiente fórmula:

en la que C y G son no metilados y X1, X2, X3 y X4 son nucleótidos.

7. Un oligonucleótido inmunoestimulador según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que incluye una pluralidad de dinucleótidos CpG no metilados.

8. Una composición, de uso como medicamento, que comprende un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicho oligonucleótido está en forma de un complejo de entrega del oligonucleótido.

9. Una composición según la reivindicación 8, en la que el oligonucleótido está asociado con un esterol, un lípido o un agente de unión específico para una célula objetivo.

10. Una composición según la reivindicación 9, en la que el oligonucleótido está asociado con colesterol, un lípido catiónico, un virosoma, un liposoma o un ligando reconocido por un receptor específico de la célula objetivo.

11. Una composición según la reivindicación 9, en la que el agente de unión específico para una célula objetivo es específico para una célula B o una célula destructora natural.

12. Una composición, de uso como medicamento, que comprende un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, Y un excipiente aceptable farmacéutica mente.

13. Un oligonucleótido inmunoestimulador según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, de uso en un método para tratar, prevenir o mejorar una deficiencia del sistema inmune.

14. Un oligonucleótido inmunoestimulador o una composlclon según la reivindicación 13, en los que dicha enfermedad o trastorno es un tumor o cáncer, o una infección vírica, fúngica, bacteriana o parasitaria.

15. Un oligonucleótido inmunoestimulador o una composición según las reivindicaciones 13 o 14, para activar células B de un sujeto.

16. Un oligonucleótido inmunoestimulador o una composición según las reivindicaciones 13 o 14, para activar células destructoras naturales de un sujeto.

17. Un oligonucleótido inmunoestimulador o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en los que, en dicho método

a) han de ponerse en contacto linfocitos obtenidos del sujeto con un oligonucleótido inmunoestimulador como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8-16, ex vivo, para producir por ello linfocitos activados; y

b) los linfocitos activados obtenidos en la etapa a) han de re-administrarse al sujeto.

18. Un oligonucleótido inmunoestimulador o una composición según la reivindicación 14, de uso para tratar, prevenir

o mejorar leucemia.

19. Un oligonucleótido inmunoestimulador o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 13-18, de uso en un método de quimioterapia.

20. Un oligonucleótido inmunoestimulador o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 13-19, formulados para administración oral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, parenteral, intraperitoneal o intratecal.

21. Un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, de uso para tratar:

(a) un sujeto humano; o,

(b) un animal vertebrado no humano, opcionalmente, un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pollo, mono, rata o ratón.

22. El uso de un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o una composlclon según una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, para la fabricación de un medicamento de uso en un método definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13-21.