Razones de ARNm en sedimentos urinarios y/u orina como marcador pronóstico y/o tratanóstico del cáncer de próstata.

Procedimiento para pronosticar el cáncer de próstata en una muestra de orina de un paciente,

que comprende:

(a) valorar la cantidad de ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata y la cantidad de un marcador específico de próstata en dicha muestra de orina;

(b) determinar un valor de la razón de dicha cantidad de dicho ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata en función de dicha cantidad de marcador específico de próstata; y

(c) comparar dicho valor de la razón con al menos un valor umbral predeterminado,

en donde un valor de la razón superior a dicho valor umbral predeterminado es indicativo de un cáncer de próstata más agresivo en comparación con un valor de la razón inferior a dicho valor umbral predeterminado.

Razones de ARNm en sedimentos urinarios y/u orina como marcador pronóstico y/o tratanóstico del cáncer de próstata.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al cáncer de próstata. Más específicamente, la presente invención se 5 refiere no sólo a un método para detectar el cáncer de próstata sino también para pronosticarlo y determinar el estadio del mismo. La presente invención se refiere a la estadificación y el pronóstico del cáncer de próstata mediante la determinación en una muestra de un paciente de la razón entre los ARNm expresados en sedimentos urinarios de pacientes. La invención se refiere adicionalmente al uso de las razones entre los ARNm prostáticos como un marcador tratanóstico del cáncer de próstata. También se describen kits que contienen cebadores de 10 ácido nucleico y kits que contienen cebadores de ácido nucleico y sondas de ácido nucleico para diagnosticar, estadificar y pronosticar el cáncer de próstata en una muestra de humano afectado con cáncer de próstata.

Antecedentes de la invención

A lo largo de la última década, el cáncer de próstata se ha vuelto el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia entre los varones y la segunda causa principal de muerte masculina por cáncer, en la población occidental, después del 15 cáncer de pulmón (Landis y col., 1998, CA Cancer J. Clin. 48 (1) :6-29) . De todos los cánceres, la incidencia del cáncer de próstata se incrementa mucho más rápido con la edad. Como la longevidad se está incrementando entre la población occidental, continúa habiendo un aumento correspondiente en el número de cánceres de próstata, con un aumento esperado del 60%, solamente en esta década. La mortalidad se ha incrementado con una tasa más lenta, pero globalmente se ha duplicado en los últimos 50 años. Aunque la enfermedad se diagnostica típicamente 20 en hombres con una edad superior a 65, su impacto sigue siendo significativo porque la esperanza de vida media de un hombre que muere por cáncer de próstata, se reduce en 9-10 años. Si se ha descubierto, el cáncer de próstata temprano se puede curar ahora quirúrgicamente en aproximadamente el 90% de los casos. Sin embargo, la enfermedad es lentamente fatal una vez que el tumor se expande fuera del área de la glándula y forma metástasis distantes. La detección precoz y la estadificación correcta tienen, por tanto, una gran importancia para la correcta 25 elección de la terapia y deben mejorar la tasa de éxito de los tratamientos y reducir el índice de mortalidad asociado con el cáncer de próstata.

A pesar de numerosos avances en estos últimos años, la precisión con la que se puede determinar el estadio de una persona que padece cáncer de próstata, sigue siendo mejorable. La razón principal de ello es la falta de ensayos moleculares muy específicos y sensibles para determinar de forma adecuada el estadio y el hecho de que el tumor 30 se expanda más allá de la próstata es generalmente microscópico más que macroscópico y, por lo tanto, difícil detectar. La exploración rectal digital de la próstata ha sido la piedra angular para determinar el estadio local del cáncer de próstata durante muchas décadas, pero a menudo se subestima la extensión de la enfermedad. Los ultrasonidos transrectales, por sí mismos, sólo tienen un valor limitado como medio para determinar el estadio del cáncer de próstata. La tomografía por ordenador y la formación de imágenes por resonancia magnética no han sido 35 generalmente satisfactorias para determinar el estadio del cáncer de próstata (Kirby, 1997, "Prostate Cancer and Prostatic Diseases" 1:2-10) . Unas aproximaciones recientes y prometedoras para determinar el estadio del cáncer de próstata implican el uso de tecnologías bioquímicas y moleculares, centradas en marcadores proteicos o en sus ácidos nucleicos correspondientes que se expresan preferentemente en las células de la próstata (Lange, 1997, en "Principles and Practice of Genitourinar y Oncology" compiladores Lippincott-Raven, Ch. 41:417-425) . 40

Los marcadores tumorales se encuentran frecuentemente en una muestra biológica de pacientes con cáncer en concentraciones elevadas comparados con los de personas sanas. Estos marcadores son frecuentemente proteínas o ácidos nucleicos que codifican tales proteínas. Los marcadores tumorales también pueden ser moléculas de ácido nucleico no codificantes. A veces tienen el potencial de ser útiles para determinar el estadio, vigilar y realizar un seguimiento de los pacientes con tumor. 45

El cambio de nivel del marcador tumoral, así como su valor comparado con una persona sana promedio, tiene el potencial de ser utilizado para monitorizar el tratamiento del cáncer. Una subida persistente o un valor superior a un umbral definido, puede ser indicativo de un cáncer recurrente o de un estadio concreto del cáncer. En algunos casos, los marcadores tumorales también se pueden utilizar para detectar las personas sospechosas de tener cáncer, estando frecuentemente dichos marcadores tumorales en un número elevado antes de la aparición de 50 cualquier prueba clínica de la enfermedad.

La identificación de los marcadores o de los antígenos tumorales asociados con el cáncer de próstata, ha estimulado un interés considerable debido a su uso en la detección, el diagnóstico, el pronóstico, la gestión clínica y el tratamiento potencial del cáncer de próstata. De hecho, pacientes con la enfermedad confinada localmente, se pueden curar frecuentemente mediante prostatectomía radical o terapia de radiación, pero para pacientes con una 55 enfermedad extendida de forma distante, no hay un tratamiento curativo disponible. Esto acentúa la necesidad de nuevas dianas terapéuticas específicas para la próstata (cáncer) . Se han descrito distintos genes que se expresan específicamente en la próstata, p. ej., PSA (Sokoll y col., 1997, "Prostate-specific antigen. Its discover y and biochemical characteristics". Urol. Clin. North. Am. 24:253-259) , el antígeno de la membrana específico de la próstata (PSM: Fair y col., 1997, "Prostatete-specific membrane antigen". Prostate 32:140-148) , el antígeno de células pluripotenciales de la próstata (Reiter y col., 1998. "Prostate stem cell antigen: a cell surface marker overexpressed in prostate cancer". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1735-1740) , TMPRSS2 (Lin y col., 1999. "Prostate-localized and androgen-regulated expression of the membrane-bound serine protease TMPRSS2". Cancer Res. 5 59:4180-4184) , PDEF (Oettgen y col., 2000. "PDEF, a novel prostate epithelium-specific ets transcription factor, interacts with the androgen receptor and activates prostate-specific antigen gene expression". J. Biol. Chem. 275:1216-1225) , el gen-1 específico de la próstata (Herness, 2003. "A novel human prostate-specific gene-1 (HPG-1) : molecular cloning, sequencing, and its potencial involvement in prostate carcinogenesis". Cancer Res. 63:329-336) , e incluso algunos ARN no codificantes (ARNnc) , tales como PCA3 (Bussemakers y col., 1999. "DD3: a new 10 prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer" [Cancer Res. 59:5975-5979], documentos de patentes WO98/045420, WO01/0235, WO2004/070056, WO2005/003387) , PCGEM1 (Srikantan y col., 2000. "PCGEM1, a prostate-specific gene, is overexpressed in prostate cancer". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:12216-12221) y la agrupación de los genes P704P, P712P y P775P (Stolk y col. 2004. P704P, P712P y P775P: "A genomic cluster of prostate-specific genes". Prostate 60:214-226) . Solamente una fracción de estos genes se ha asociado con 15 el pronóstico, la progresión y/o la capacidad metastásica del cáncer de próstata y con potencial para ser dianas terapéuticas valiosas. Los marcadores tumorales de la próstata más conocidos, utilizados para la vigilancia, el seguimiento, la supervisión y la elección del tratamiento contra el cáncer de próstata son el PSA (antígeno específico de la próstata) y el antígeno PSM (de membrana específico de la próstata) .

PSA es una proteasa de serina codificada por el gen PSA situado en el cromosoma 19. Esta glicoproteína se 20 expresa bajo control andrógeno en las células epiteliales glandulares de la próstata y es secretada en el plasma seminal para licuarla. La proteína PSA está confinada normalmente en la próstata, pero en el caso de enfermedad prostática, tal como cáncer o BPH (hiperplasia benigna de la próstata) , la PSA se filtra a la sangre en donde está presente en diferentes formas, incluyendo una forma que está unida a complejos proteicos y una forma no unida a los mismos (EL-Shirbiny, 1994, Adv. Clin. Chem. 31:99) . La medición de las concentraciones totales en suero de 25 PSA es uno de los ensayos bioquímicos empleados más frecuentemente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para pronosticar el cáncer de próstata en una muestra de orina de un paciente, que comprende:

(a) valorar la cantidad de ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata y la cantidad de un marcador específico de próstata en dicha muestra de orina; 5

(b) determinar un valor de la razón de dicha cantidad de dicho ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata en función de dicha cantidad de marcador específico de próstata; y

(c) comparar dicho valor de la razón con al menos un valor umbral predeterminado,

en donde un valor de la razón superior a dicho valor umbral predeterminado es indicativo de un cáncer de próstata más agresivo en comparación con un valor de la razón inferior a dicho valor umbral predeterminado. 10

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicho valor umbral predeterminado se define a partir de una población de pacientes que tienen cáncer de próstata en diferentes estadios o con diferente agresividad, preferiblemente de acuerdo con la puntuación de Gleason.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en donde dicha muestra de orina se obtiene después de una exploración rectal digital. 15

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha cantidad de marcador específico de próstata es la cantidad de ARNm del marcador específico de próstata.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende:

(a) poner en contacto dicha muestra de orina con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata; 20

(b) poner en contacto dicha muestra de orina con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ARNm del marcador específico de próstata;

(c) determinar la cantidad de ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata y la cantidad de ARNm del marcador específico de próstata presentes en dicha muestra de orina;

(d) determinar un valor de la razón de dicha cantidad de ARNm de PCA3 en función de dicha cantidad de ARNm del 25 marcador específico de próstata;

(e) comparar dicho valor de la razón de dicha cantidad de ARNm de PCA3 en función de dicha cantidad de ARNm del marcador específico de próstata con al menos un valor umbral predeterminado,

en donde un valor de la razón superior a dicho valor umbral predeterminado es indicativo de la presencia de un cáncer de próstata más agresivo en comparación con un valor de la razón inferior a dicho valor umbral 30 predeterminado, que es indicativo de la presencia de un cáncer de próstata menos agresivo.

6. Procedimiento para valorar el volumen tumoral de un cáncer de próstata en una muestra de orina, que comprende:

(a) valorar la cantidad de un ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de próstata y la cantidad de marcador específico de próstata en dicha muestra; 35

(b) determinar un valor de la razón de dicha cantidad de dicho ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de próstata en función dicha cantidad del marcador específico de próstata;

(c) comparar dicho valor de la razón con al menos un valor umbral predeterminado,

en donde un valor de la razón superior a dicho valor umbral predeterminado es indicativo de un mayor volumen tumoral del cáncer de próstata en comparación con un valor de la razón inferior a dicho valor umbral 40 predeterminado.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:

(a) valorar la cantidad de un ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de próstata y la cantidad de marcador específico de próstata en dicha muestra de orina en un primer punto temporal;

(b) determinar un valor de la razón de dicha cantidad de dicho ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de 45 próstata en función de dicha cantidad de marcador específico de próstata;

(c) repetir las etapas (a) y (b) con una muestra de orina procedente de dicho paciente en un punto temporal posterior; y

(d) comparar el valor de la razón obtenido en la etapa (b) con el valor de la razón obtenido en la etapa (c) ,

en donde un valor superior de la razón en la etapa (c) comparado con el valor de la razón obtenido en la etapa (b) es indicativo de la progresión del cáncer de próstata y de un mayor volumen tumoral a lo largo del tiempo. 5

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende:

(a) poner en contacto dicha muestra de orina con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de próstata;

(b) poner en contacto dicha muestra de orina con al menos un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico del marcador específico de próstata; 10

(c) determinar la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de próstata y la cantidad de ácido nucleico del marcador específico de próstata presentes en dicha muestra de orina;

(d) determinar un valor de la razón de dicha cantidad de ácido nucleico de PCA3 en función de dicha cantidad de ácido nucleico del marcador específico de próstata;

(e) repetir las etapas (a) hasta (d) en un punto temporal posterior; y 15

(f) comparar el valor de la razón obtenido en la etapa (d) con el valor de la razón obtenido en la etapa (e) , en donde un valor de la razón superior en la etapa (e) comparado con el valor de la razón obtenido en la etapa (d) es indicativo de la progresión del cáncer de próstata a lo largo del tiempo.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde se utiliza una reacción de amplificación para determinar la cantidad de ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de próstata. 20

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en donde dicha reacción de amplificación se selecciona del grupo consistente en:

(a) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ;

(b) ensayo de amplificación basada en ácidos nucleicos (NASBA) ;

(c) amplificación mediada por la transcripción (TMA) ; 25

(d) reacción en cadena de la ligasa (LCR) ; y (e) amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA) .

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde la cantidad de dicho ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de próstata y de dicho ácido nucleico del marcador específico de próstata se determina con un ensayo de hibridación. 30

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cantidad de dicho ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de próstata se valora con al menos un oligonucleótido que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de PCA3 seleccionada del grupo consistente en:

(a) una secuencia de ácido nucleico descrita en la SEQ ID NO:1;

(b) una secuencia de ácido nucleico descrita en la SEQ ID NO:2; y 35

(c) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones muy rigurosas con una secuencia de ácido nucleico de (a) o de (b) .

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 6, 7 y 12, en donde se valora la cantidad de proteína del marcador específico de próstata contenida en dicha muestra biológica.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en donde se emplea un anticuerpo para valorar dicha cantidad de 40 proteína del marcador específico de próstata.

15. Procedimiento según la reivindicación 1 para la estadificación del cáncer de próstata, en donde dicho procedimiento comprende además:

(d) correlacionar dicho valor de la razón con un estadio concreto del cáncer de próstata, en donde un valor de la razón superior a dicho valor umbral predeterminado indica un estadio más avanzado del cáncer de próstata en comparación con un valor de la razón inferior a dicho valor umbral predeterminado, con lo que se estadifica el cáncer de próstata.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende adicionalmente determinar la puntuación de Gleason de una muestra de próstata procedente de dicho paciente y correlacionar dicho valor de la 5 razón PCA3/marcador específico de próstata y dicha puntuación de Gleason con un riesgo de mortalidad asociado a dicha enfermedad.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en donde dicho valor de la razón PCA3/marcador específico de próstata y dicha puntuación de Gleason se correlacionan con una predicción de la respuesta del paciente y/o una previsión del riesgo de enfermedad. 10

18. Procedimiento según las reivindicaciones 7 u 8, en donde dicha muestra de orina se obtiene a partir de un paciente que está en tratamiento contra el cáncer de próstata entre dicho primer punto temporal y dicho punto temporal posterior, con lo que se monitoriza un efecto de dicho tratamiento sobre el crecimiento tumoral del cáncer o la progresión del cáncer de próstata.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y 15 a 18, que comprende: 15

(a) realizar un ensayo in vitro de amplificación de ácidos nucleicos en dicha muestra de orina de dicho paciente o extracto de la misma con una primera pareja de cebadores que es específica de una secuencia de ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de próstata y una segunda pareja de cebadores que es específica de una secuencia de ácido nucleico del marcador específico de próstata;

(b) cuantificar dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 y dicha secuencia de ácido nucleico del marcador 20 específico de próstata; y

(c) calcular una razón normalizada de PCA3 en función del marcador específico de próstata, en donde dicha razón se puede correlacionar con un nivel de ARNm de PCA3 y un nivel de ARNm del marcador específico de próstata en dicho paciente,

en donde dicha razón normalizada de PCA3 en función del marcador específico de próstata se correlaciona 25 positivamente con un grado o un estadio del cáncer de próstata.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde dicho marcador específico de próstata se selecciona del grupo que consiste en: PSA, hK2/KLK2, PMSA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida, PCGEM1, NKX3.1, antígeno de células madre prostáticas (PSCA) , gen 1 inductor de tumor de próstata (PTI-1) , PCGEM-1, PDEF, TMPRSS2 y prostasa. 30