Racemasa BsrAh para la racemización de aminoácidos.

Racemasa BsrAh para la racemización de aminoácidos.

En la presente invención se incluye una racemasa de Aeromonas hydrophila la cual presenta un amplio espectro de racemización y por tanto permite la obtención de L aminoácidos desde el enantiómero D y de D aminoácidos desde el enantiómero L.

Por tanto la presente invención también se refiere tanto al uso de dicha racemasa in vitro como a un método de racemización de aminoácidos. Además la presente invención se refiere a un método de síntesis de muropéptidos.

La presente invención describe una racemasa presente en el organismo Aeromonas hydrophila la cual produce la racemización reversible de aminoácidos a su forma enantiomérica (L, D) . Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la biotecnología.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En la naturaleza, de forma habitual, los aminoácidos se suelen encontrar en su forma enantiomérica L (levógira) . Las proteínas que forman parte de los organismos vivos están formadas únicamente por los enantiómeros L de los aminoácidos. Sin embargo, existen diversas estructuras en la naturaleza que incorporan algunos enantiómeros D (dextrógiros) , como pueden ser por ejemplo, pequeños polipéptidos bacterianos, normalmente inferiores a 20 aminoácidos tales como aquellos que conforman el peptidoglicano (PG) de las paredes bacterianas (Vollmer W. et al., 2008 FEMS Microbiol Rev 32: 149-167) o bien como constituyentes de péptidos no ribosomales (Strieker M. et al., 2010, Curr Opin Struct Biol 20: 234-240) .

Los péptidos que incluyen D-aminoácidos (es decir, aminoácidos de forma enantiomérica D) , de forma habitual, no son sintetizados mediante la maquinaria habitual de formación de proteínas mediante la síntesis de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y la incorporación de los aminoácidos mediante la mediación del ARN de transferencia, sino mediante la polimerización directa de unos aminoácidos a otros mediante enzimas bacterianas.

Los D-aminoácidos que forman habitualmente parte del peptidoglicano y que se denominan D-aminoácidos canónicos son los aminoácidos D-alanina y D-glutámico. Sin embargo algunas bacterias son capaces de producir D-aminoácidos no canónicos (NCDAAs) y liberarlos al ambiente extracelular en altas concentraciones (Lam H et al. Science. 2009, 325: 1552-1555) .Los NCDAAs tienen influencia en la composición y por tanto en la consistencia y resistencia del peptidoglicano en bacterias, permitiendo

que las bacterias que los incluyen presenten una mayor resistencia a los cambios ambientales a los que se enfrenta. Además de su influencia en el peptidoglicano, los NCDAAs tienen influencia en otros procesos como por ejemplo la dispersión del biofilm que se puede formar en una superficie viva o inerte, (Kolodkin-Gal I et al. 2010. Science 328: 627-629) . Además también presentan influencia en la germinación de esporas en diversas especies bacterianas como por ejemplo organismos del género Bacillus.

Debido a las múltiples aplicaciones de los D-aminoácidos, especialmente a su capacidad para formar péptidos antibacterianos que permitan la inhibición de biofilms, es de interés su producción a nivel industrial. Sin embargo, en la actualidad su producción resulta cara ya que se utilizan catalizadores químicos. De esta forma se puede pasar de L-aminoácidos, los cuales son abundantes en la naturaleza y baratos de obtener, a D-aminoácidos. Los catalizadores utilizados son por ejemplo el piridoxal fosfato o el ácido salicílico (Gong et al. Inorg Chem. 2010, 49:7692-7699) . Sin embargo estos catalizadores presentan un rendimiento de reacción muy bajo además de un elevado coste, lo que hace el proceso de obtención de D-aminoácidos poco rentable económicamente. Esto provoca que el posterior uso de los mismos e investigación de nuevos compuestos que los incluyen resulte limitado dado el coste.

Para tratar de solventar los problemas incluidos en este método de obtención de aminoácidos, en la actualidad se están desarrollando otras vías de obtención de forma que se solventen las limitaciones y se acelere el proceso de obtención. De esta forma se están tratando de utilizar biocatalizadores como por ejemplo racemasas específicas de aminoácidos. Esta aproximación presenta como inconveniente que estas enzimas presentan especificidad de sustrato y por tanto sería necesaria una enzima para cada tipo de sustrato, lo que no permitiría usar mezclas complejas de L-aminoácidos como material de partida para abaratar el proceso. Además la necesidad de usar un catalizador para cada reacción implica un incremento en los costes de producción. Además, en la actualidad no se conocen suficientes enzimas monoespecíficas que se puedan combinar para llevar a cabo el procedimiento.

Por tanto, resulta necesario conseguir elementos que permitan la obtención de D-aminoácidos a partir de L-aminoácidos de forma que el proceso sea barato, rápido y

sencillo, minimizando el número de agentes implicados, y que permita una multiespecificidad del proceso.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una enzima de Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila (ATCC 7966) la cual se encuentra codificada por el locus YP_857116 de este organismo, y denominada BsrAh (Broad spectrum racemase in Aeromonas hydrophila, o racemasa de Aeromonas hydrophila de amplio espectro) . Esta enzima presenta multiespecificidad de racemización frente a diversos aminoácidos de forma que puede transformar enantiómeros L en enantiómeros D y viceversa. Los aminoácidos que pueden ser racemizados por esta enzima son tanto naturales como sintéticos. De esta forma la enzima puede ser utilizada para racemizar aminoácidos partiendo tanto de un sólo aminoácido como de mezclas de aminoácidos, y tanto de un enantiómero puro como de mezclas de enantiómeros. La enzima de la presente invención, secuencia SEQ ID NO: 1, presenta como ventaja que para llevar a cabo la racemización de aminoácidos no requiere un aporte exógeno de energía. En la presente invención se demuestra cómo la enzima reacciona con los aminoácidos y a partir de L-aminoácidos, D-aminoácidos, puros o mezclas de estos se alcanza un equilibrio que está siempre próximo a una relación 1:1 entre las formas enantioméricas de los aminoácidos sustrato.

Dada la utilidad de los enantiómeros D, resulta de especial relevancia dentro de la biotecnología la capacidad de la enzima racemasa BsrAh de racemizar de enantiómero L, el cual es fácil de obtener y barato dado que es el presente de forma mayoritaria en las proteínas de los organismos en la naturaleza, a enantiómero D. También resulta interesante la capacidad de alcanzar un equilibrio de reacción, de forma que se puede ir eliminando u obteniendo el enantiómero D según se va produciendo de forma que dejando evolucionar la reacción se alcanzan de nuevo ciertas cantidades del enantiómero de interés al alcanzarse el equilibrio de nuevo. El equilibrio se alcanza dejando evolucionar la reacción. Sin embargo, puntos cercanos al equilibrio se alcanzan rápidamente y varían en función del tiempo que se deje evolucionar la reacción.

Otro elemento que resulta interesante de la racemasa BsrAh es la capacidad de racemizar los aminoácidos a partir de mezclas racémicas o enantioméricas impuras, ya que estas son más baratas y fáciles de obtener que el enantiómero de forma pura.

De igual forma que ocurre entre muchas de las proteínas descritas, como por ejemplo entre proteínas homólogas en diferentes organismos, BsrAh podría tener alterado algún aminoácido, con respecto a SEQ ID NO: 1 sin que se produjera una alteración sustancial en la proteína (Muth T. et al., 2012, Bioinformatics 28, 584-589) . Esto significa que esta alteración no sería determinante en el polipéptido ni para su estructura ni para su actividad. La enzima BsrAh puede por lo tanto presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia aminoacídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad de la enzima descrita en la presente invención. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la secuencia de la variante son similares en conjunto, e idénticas en muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustituciones se dan entre aminoácidos que presentan similares características como por ejemplo en cuanto a polaridad, tamaño o carga, e incluyen, aunque sin limitarse, sustituciones entre ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp) , entre lisina (Lys) y arginina (Arg) , entre asparragina (Asn) y glutamina (Gln) , entre serina (Ser) y treonina (Thr) , y entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala) , leucina (Leu) , valina (Val) e isoleucina (Ile) . Las variaciones pueden ser variaciones existentes en la naturaleza como por ejemplo variaciones alélicas, o generadas artificialmente como por ejemplo, mediante mutagénesis o síntesis directa. Estas variaciones no provocan modificaciones esenciales en las características o propiedades esenciales del polipéptido, por lo que dichas variantes mantienen su actividad biológica. Todos estos péptidos pueden ser péptidos presentes en la naturaleza o bien ser producidos de forma artificial como por ejemplo, aunque sin limitarse,... [Seguir leyendo]

1. Uso de una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 como catalizador para la racemización de al menos un aminoácido seleccionado de la lista que comprende cisteína, histidina, lisina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina.

2. Uso de una enzima según la reivindicación 1 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 98%.

3. Uso de una enzima según la reivindicación 2 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 99%.

4. Uso de una enzima según la reivindicación 3 donde la enzima comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

5. Uso de una enzima según la reivindicación 4 donde la enzima consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el aminoácido es al menos un aminoácido seleccionado de la lista que comprende la histidina, la lisina, la arginina, la ornitina y la glutamina.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la racemización se hace a partir de una mezcla enantiomérica.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la racemización se hace a partir de un enantiómero puro.

9. Uso según la reivindicación 8 donde el enantiómero puro es el enantiómero L.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la racemización se hace a partir de una mezcla de aminoácidos.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde la enzima se encuentra inmovilizada.

12. Método de racemización de aminoácidos que comprende poner en contacto al menos un aminoácido seleccionado de la lista que comprende cisteína, histidina, lisina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina con una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1.

13. Método según la reivindicación 12 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 98%.

14. Método según la reivindicación 13 donde la identidad con respecto a la secuencia 15 SEQ ID NO: 1 es de al menos un 99%.

15. Método según la reivindicación 14 donde la enzima comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

16. Método según la reivindicación 15 donde la enzima consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 donde el aminoácido es al menos un aminoácido seleccionado de la lista que comprende la histidina, la lisina, 25 la arginina, la ornitina y la glutamina.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 donde la racemización se hace a partir de una mezcla enantiomérica.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 donde la racemización se hace a partir de un enantiómero puro.

20. Método según la reivindicación 19 donde el enantiómero puro es el enantiómero L.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, donde la racemización se hace a partir de una mezcla de aminoácidos.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21 donde la enzima se encuentra inmovilizada.

23. Método de producción de un muropéptido que comprende: a) poner en contacto al menos un L-aminoácido seleccionado de la lista que comprende cisteína, histidina, lisina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina con una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 para racemizar el aminoácido a su forma D, y b) poner en contacto el D-aminoácido obtenido en (a) con un muropéptido y al menos una L, D transpeptidasa y/o al menos una ligasa.

24. Método según la reivindicación 23 donde la identidad de la enzima con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 98%.

25. Método según la reivindicación 24 donde la identidad de la enzima con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 99%.

26. Método según la reivindicación 25 donde la enzima comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

27. Método según la reivindicación 26 donde la enzima consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27 donde el muropéptido que se sintetiza es un muropéptido no canónico.

29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28 donde el aminoácido del paso (a) se encuentra en forma de mezcla enantiomérica.

30. Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28 donde el aminoácido del paso (a) se encuentra en una forma enantiomérica pura.

31. Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30 donde el aminoácido del paso (a) se encuentra en una mezcla de aminoácidos.

FIG 1

BsrAh

FIG.2

FIG.3

FIG.4

FIG.5

FIG.6

FIG.7

FIG.8

FIG.9

FIG.10

FIG.11

FIG.12

FIG.13

FIG.14

FIG.15 A

FIG.15 B

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Universidad Autónoma de Madrid

<120> Racemasa BsrAh para la racemización de aminoácidos <130> ES1595.48

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 408

<212> PRT

<213> Aeromonas hydrophila <400> 1

Met His Lys Lys Thr Leu Leu Ala Thr Leu Ile Leu Gly Leu Leu Ala 1 5 10 15

Gly Gln Ala Val Ala Ala Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Ser Asp His Arg 20 25 30

Asn Gly Glu Val Gln Thr Ala Ser Asn Ala Trp Leu Glu Val Asp Leu 35 40 45

Gly Ala Phe Glu His Asn Ile Gln Thr Leu Lys Asp Arg Leu Gly Asp 50 55 60

Lys Gly Pro Lys Ile Cys Ala Ile Met Lys Ala Asp Ala Tyr Gly His 65 70 75 80

Gly Ile Asp Leu Leu Val Pro Ser Val Val Lys Ala Gly Ile Pro Cys 85 90 95

Ile Gly Ile Ala Ser Asn Glu Glu Ala Arg Val Ala Arg Glu Lys Gly 100 105 110

Phe Thr Gly Arg Leu Met Arg Val Arg Ala Ala Thr Pro Ala Glu Val 115 120 125

Glu Gln Ala Leu Pro Tyr Lys Met Glu Glu Leu Ile Gly Ser Leu Val 130 135 140

Ser Ala Gln Gly Ile Ala Asp Ile Ala Gln Arg His His Thr Asn Ile 145 150 155 160

Pro Val His Ile Ala Leu Asn Ser Ala Gly Met Ser Arg Asn Gly Ile 165 170 175

Asp Leu Arg Leu Ala Asp Ser Lys Glu Asp Ala Leu Ala Met Leu Lys 180 185 190

Leu Lys Gly Ile Thr Pro Val Gly Ile Met Thr His Phe Pro Val Glu 195 200 205

Glu Lys Glu Asp Val Lys Met Gly Leu Ala Gln Phe Lys Leu Asp Ser 210 215 220

Gln Trp Leu Leu Glu Ala Gly Lys Leu Asp Arg Ser Lys Ile Thr Ile 225 230 235 240

His Ala Ala Asn Ser Phe Ala Thr Leu Glu Val Pro Asp Ala Tyr Phe 245 250 255

Asp Met Val Arg Pro Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Ser Ile Pro Ser 260 265 270

Tyr Thr Glu Tyr Lys Arg Val Met Ala Phe Lys Thr Gln Val Ala Ser 275 280 285

Val Asn His Tyr Pro Ala Gly Asn Thr Val Gly Tyr Asp Arg Thr Phe 290 295 300

Thr Leu Lys Arg Asp Ser Trp Leu Ala Asn Leu Pro Leu Gly Tyr Ser 305 310 315 320

Asp Gly Tyr Arg Arg Ala Leu Ser Asn Lys Ala Tyr Val Leu Ile Gln 325 330 335

Gly Gln Lys Val Pro Val Val Gly Lys Thr Ser Met Asn Thr Ile Met 340 345 350

Val Asp Val Thr Asp Leu Lys Gly Val Lys Pro Gly Asp Glu Val Val 355 360 365

Leu Phe Gly Arg Gln Gly Glu Ala Glu Val Lys Gln Ala Asp Leu Glu 370 375 380

Glu Tyr Asn Gly Ala Leu Leu Ala Asp Met Tyr Thr Ile Trp Gly Tyr 385 390 395 400

Thr Asn Pro Lys Lys Ile Lys Arg 405

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sentido <400> 2 aaaccatggc cccaagaaga tcaagcgct 29

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido antisentido

<400> 3 aaaaagcttg cgcttgatct tcttggggtt ggtgtagccc cagatg 46