Racemasa BsrAb para la racemización de aminoácidos.

Racemasa BsrAb para la racemización de aminoácidos.

En la presente invención se incluye una racemasa de Acinetobacter baumannii (BsrAb) la cual presenta un amplio espectro de racemización y por tanto permite la obtención de L aminoácidos desde el enantiómero D y de D aminoácidos desde el enantiómero L.

Por tanto la presente invención se refiere tanto al uso de dicha racemasa in vitro y también a un método de racemización de aminoácidos. Además la presente invención se refiere a un método de síntesis de muropéptidos.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201331890.

Solicitante: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: CAVA VALENCIANO,FELIPE, ESPAILLAT FERNÁNDEZ,Akbar.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12P13/04 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › alfa- o beta-Aminoácidos.
  • C12P21/00 C12P […] › Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00).

PDF original: ES-2538719_A1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

La presente invención describe una racemasa presente en el organismo Acinetobacter baumannii la cual produce la racemización reversible de aminoácidos a su forma enantiomérica (L, D). Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la biotecnología.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En la naturaleza, de forma habitual, los aminoácidos se suelen encontrar en su forma enantiomérica L (levógira). Las proteínas que forman parte de los organismos vivos están formadas únicamente por los enantiómeros L de los aminoácidos. Sin embargo, existen diversas estructuras en la naturaleza que incorporan algunos enantiómeros D (dextrógiros), como pueden ser por ejemplo, pequeños polipéptidos bacterianos, normalmente inferiores a 20 aminoácidos tales como aquellos que conforman el peptidoglicano (PG) de las paredes bacterianas (Vollmer W et al. 2008 FEMS MicrobioI Rev 32: 149-167) o bien como constituyentes de péptidos no ribosomales (Strieker M et al. 2010 Curr Opin Struct Biol 20:234-240).

Los péptidos que incluyen D-aminoácidos (es decir, aminoácidos de forma enantiomérica D), de forma habitual, no son sintetizados mediante la maquinaria habitual de formación de proteínas mediante la síntesis de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y la incorporación de los aminoácidos mediante la mediación del ARN de transferencia, sino mediante la polimerización directa de unos aminoácidos a otros mediante enzimas bacterianas.

Los D-aminoácidos que forman habitualmente parte del peptidoglicano y que se denominan D-aminoácidos canónicos son los aminoácidos D-alanina y D-glutámico. Sin embargo algunas bacterias son capaces de producir D-aminoácidos no canónicos (NCDAAs) y liberarlos al ambiente extracelular en altas concentraciones (Lam H et al. Science. 2009, 325: 1552-1555). Los NCDAAs tienen influencia en la composición y por tanto en la consistencia y resistencia del peptidoglicano en bacterias, permitiendo

que las bacterias que los incluyen presenten una mayor resistencia a los cambios ambientales a los que se enfrentan. Además de su influencia en el peptidoglicano, los NCDAAs tienen influencia en otros procesos como por ejemplo la dispersión del biofilm que se puede formar en una superficie viva o inerte, (Kolodkin-Gal I et al. 2010. Science 328: 627-629). Además también presentan influencia en la germinación de esporas en diversas especies bacterianas como por ejemplo organismos del género Bacillus.

Debido a las múltiples aplicaciones de los D-aminoácidos, especialmente a su capacidad para formar péptidos antibacterianos que permitan la inhibición de biofilms, es de interés su producción a nivel industrial. Sin embargo, en la actualidad su producción resulta cara ya que se utilizan catalizadores químicos. De esta forma se puede pasar de L-aminoácidos, los cuales son abundantes en la naturaleza y baratos de obtener, a D-aminoácidos. Los catalizadores utilizados son por ejemplo el piridoxal fosfato o el ácido salicílico (Gong et al. Inorg Chem. 2010, 49:7692-7699). Sin embargo estos catalizadores presentan un rendimiento de reacción muy bajo además de un elevado coste, lo que hace el proceso de obtención de D-aminoácidos poco rentable económicamente. Esto provoca que el posterior uso de los mismos e investigación de nuevos compuestos que los incluyen resulte limitado dado el coste.

Para tratar de solventar los problemas incluidos en este método de obtención de aminoácidos, en la actualidad se están desarrollando otras vías de obtención de forma que se solventen las limitaciones y se acelere el proceso de obtención. De esta forma se están tratando de utilizar biocatalizadores como por ejemplo racemasas específicas de aminoácidos. Esta aproximación presenta como inconveniente que estas enzimas presentan especificidad de sustrato y por tanto sería necesaria una enzima para cada tipo de sustrato, lo que no permitiría usar mezclas complejas de L-aminoácidos como material de partida para abaratar el proceso. Además la necesidad de usar un catalizador para cada reacción implica un incremento en los costes de producción. Además, en la actualidad no se conocen suficientes enzimas monoespecíficas que se puedan combinar para llevar a cabo el procedimiento.

Por tanto, resulta necesario conseguir elementos que permitan la obtención de D- aminoácidos a partir de L-aminoácidos de forma que el proceso sea barato, rápido y

sencillo, minimizando el número de agentes implicados, y que permita una multiespecificidad del proceso.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una enzima de Acinetobacter baumannii la cual se encuentra codificada por el locus YP_001084387 de este organismo, la cual aparece anotada como una putativa alanina racemasa, y la hemos denominado BsrAb (Broad spectrum racemase in Acinetobacter baumannii, o racemasa de Acinetobacter baumannii de amplio espectro). Esta enzima presenta multiespecificidad de racemización frente a diversos aminoácidos de forma que puede transformar enantiómeros L en enantiómeros D y viceversa. Los aminoácidos que pueden ser racemizados por esta enzima son tanto naturales como sintéticos. De esta forma la enzima puede ser utilizada para racemizar aminoácidos partiendo tanto de un sólo aminoácido como de mezclas de aminoácidos, y tanto de un enantiómero puro como de mezclas de enantiómeros. La enzima de la presente invención, secuencia SEQ ID NO: 1, presenta como ventaja que para llevar a cabo la racemización de aminoácidos no requiere un aporte exógeno de energía. En la presente invención se demuestra cómo la enzima reacciona con los aminoácidos y a partir de L-aminoácidos, D- aminoácidos, puros o mezclas de estos se alcanza un equilibrio que está siempre próximo a una relación 1:1 entre las formas enantioméricas de los aminoácidos sustrato.

Dada la utilidad de los enantiómeros D, resulta de especial relevancia dentro de la biotecnología la capacidad de la enzima racemasa BsrAb de racemizar de enantiómero L, el cual es fácil de obtener y barato dado que es el presente de forma mayoritaria en las proteínas de los organismos en la naturaleza, a enantiómero D. También resulta interesante la capacidad de alcanzar un equilibrio de reacción, de forma que se puede ir eliminando u obteniendo el enantiómero D según se va produciendo de forma que dejando evolucionar la reacción se alcanzan de nuevo ciertas cantidades del enantiómero de interés al alcanzarse el equilibrio de nuevo. El equilibrio se alcanza dejando evolucionar la reacción. Sin embargo, puntos cercanos al equilibrio se alcanzan rápidamente y varían en función del tiempo que se deje evolucionar la reacción.

Otro elemento que resulta interesante de la racemasa BsrAb es la capacidad de racemizar los aminoácidos a partir de mezclas racémicas o enantioméricas impuras, ya que estas son más baratas y fáciles de obtener que el enantiómero de forma pura.

De igual forma que ocurre entre muchas de las proteínas descritas, como por ejemplo entre proteínas homologas en diferentes organismos, BsrAb podría tener alterado algún aminoácido, con respecto a SEQ ID NO: 1 sin que se produjera una alteración sustancial en la proteína (Muth T. etal. 2012 Bioinformatics 28:584-586). Esto significa que esta alteración no sería determinante en el polipéptido ni para su estructura ni para su actividad. La enzima BsrAb puede por lo tanto presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia aminoacídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad de la enzima descrita en la presente invención. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la secuencia de la variante son similares en conjunto, e idénticas en muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustituciones se dan entre aminoácidos que presentan similares características como por ejemplo en cuanto a polaridad, tamaño o carga, e incluyen, aunque sin limitarse, sustituciones entre ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp), entre lisina (Lys) y arginina (Arg), entre asparragina (Asn) y glutamina (Gln), entre serina (Ser) y treonina (Thr), y entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala), leucina (Leu), valina (Val) e isoleucina (lie). Las variaciones pueden ser variaciones existentes en la naturaleza como por ejemplo variaciones alélicas, o generadas artificialmente como por ejemplo, mediante mutagénesis o síntesis directa. Estas variaciones no provocan modificaciones esenciales en las características o propiedades esenciales del polipéptido, por lo que dichas variantes mantienen su actividad biológica. Todos estos péptidos pueden ser péptidos presentes en la naturaleza o bien ser producidos de forma artificial como por ejemplo, aunque... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Uso de una enzima que compr ende una secuencia de aminoácidos que t iene aI menos un 95% de identidad con respecto a la secuen cia SEQ ID NO: 1 como catalizador para la race mización de al menos un aminoácido selección ado de la lista que comprende ciste ína, histidina, lisina, leu ciña, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina.

2. Uso de u na enzima según la reivi ndicación 1 donde la identidad con respecto a I a secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 98%.

3. Uso de u na enzima según la reivi ndicación 2 donde la identidad con respecto a I a secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 99%.

4. Uso de una enzima según la r eivindicación 3 donde la enzima comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

5. Uso de una enzima según la reivindicado n 4 donde la enzima consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

6. Uso seg ún cualquie ra de las r eivindicaciones 1 a 5 donde el a minoácido es al menos un aminoácido seleccionado de la lista q ue comprende la histidina, la lisina, la arginina, la ornitina y la glutamina.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la racemización se hace a partir de una mezcla enantiomérica.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la racemización se hace a partir de un enantiómero puro.

9. Uso según la reivindicación 8 donde el enantiómero puro es el enantiómero L.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la racemización se hace a partir de una mezcla de aminoácidos.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde la enzima se encuentra inmovilizada.

12. Método de racemización de aminoácidos que comprende poner en contacto al menos un aminoácido selección ado de la lista que comprende cisteína, histidina, lisina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina con una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1.

13. Método según la reivindicación 12 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 98%.

14. Método según la reivindicación 13 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 99%.

15. Método según la reivindicación 14 donde la enzima co mprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

16. Método según la re ¡vindicación 15 donde la enzima co nsiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 1 6 donde el aminoácido es al menos un aminoácido seleccio nado de la lista que comprende la histidina, la lisina, la arginina, la ornitina y la glutamina.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 donde la racemización se hace a partir de una mezcla enantiomérica.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 donde la racemización se hace a partir de un enantiómero puro.

20. Método según la reivindicación 19 donde el enantiómero puro es el enantiómero L.

21. Método según cualq uiera de las reivindicaciones 12 a 2 0, donde la racemización se hace a partir de una mezcla de aminoácidos.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21 donde la enzima se encuentra inmovilizada.

23. Método de producción de un muropéptido que comprende:

a) Poner e n contacto al menos un L-amin oácido sele ccionado de la lista que comprende cisteína, histidina, lisina, leu cina, metionina, asparrag ina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina con una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 para racemizar el aminoácido a su forma D, y

b) poner en contacto el D-aminoácido obtenido en (a) con un muropéptido y al menos una L, D transpeptidasa y/o al menos una ligasa.

24. Método según la reivindicación 23 donde la identidad de la enzima con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 98%.

25. Método según la reivindicación 24 donde la identidad de la enzima con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 99%.

26. Método según la reivindicación 25 donde la enzima comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

27. Método según la re ivindicación 26 donde la enzima co nsiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

28. Método según cualquiera de las reivindica ciones 23 a 27 donde el muropéptido que se sintetiza es un muropéptido no canónico.

29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28 donde el aminoácido del paso (a) se encuentra en forma de mezcla enantiomérica.

30. Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29 donde el aminoácido del paso (a) se encuentra en una forma enantiomérica pura.

31. Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30 donde el aminoácido del 5 paso (a) se encuentra en una mezcla de aminoácidos.


 

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