Proteína de unión al antígeno de Goodpasture y su detección.

Uso de una molécula de unión a la proteína de unión al antígeno de Goodpasture (GPBP) para detectar la GPBP de 77 kDa en una muestra de plasma,

donde la molécula de unión a GPBP es un anticuerpo, un aptámero o un sustrato de GPBP.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2009/005258.

Solicitante: Fibrostatin, Sociedad Limitada.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: SAUS, JUAN, REVERT,FERNANDO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/00 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
  • C12N9/12 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).

PDF original: ES-2535258_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Proteína de unión al antígeno de Goodpasture y su detección

Referencia cruzada Esta solicitud reivindica el beneficio para las Solicitudes de Patente Provisionales con los Nos de Serie 61/082741 expedida el 22 de julio de 2008 y 61/085211 expedida el 31 de julio de 2008.

Antecedentes de la invención La conformación del dominio no colagenoso (NC1) de la cadena α3 del colágeno IV de la membrana basal [α3 (IV) NC1] depende en parte de la fosforilación. La proteína de unión al antígeno de Goodpasture (GPBP) (documentos WO 00/50607; WO 02/061430) es una nueva proteína quinasa no convencional que cataliza la isomerización conformacional del dominio α3 (IV) NC1 durante su ensamblaje supramolecular, dando como resultado la producción y estabilización de los múltiples conformadores de α3 (IV) NC1 en las membranas basales. Se han asociado los niveles elevados de GPBP con la producción de conformadores no tolerantes de α3 (IV) NC1, que llevan a cabo la respuesta autoinmunitaria que media la enfermedad de Goodpasture ("GP") . En los pacientes de GP, los autoanticuerpos contra el dominio C terminal no colagenoso (NC1) de la cadena α3 del colágeno de tipo IV ("antígeno de Goodpasture" o "antígeno GP") causa una glomerulonefritis progresiva rápidamente y a menudo hemorragia pulmonar, las dos manifestaciones clínicas cardinales del síndrome de GP.

La identificación de GPBP proporcionó métodos para la identificación de compuestos para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios, cáncer, trastornos mediados por el plegamiento defectuoso de las proteínas y la apoptosis aberrante, y también proporcionó agentes terapéuticos potenciales para estos trastornos. Por lo tanto, la identificación de nuevas isoformas de GPBP podría ser ventajosa en al menos estos campos.

Sumario de la invención La presente invención proporciona el uso de una molécula de unión a GPBP de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, métodos para detectar GPBP en la circulación de acuerdo con las reivindicaciones 7-8 y un método para aislar isoformas nativas de GPBP de acuerdo con la reivindicación 9. Se divulgan otros aspectos de la solicitud:

En un primer aspecto, la presente solicitud divulga polipéptidos aislados con una pureza del 90 % o mayor, que 35 consisten en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 2 (91 kD GPBP) .

En un segundo aspecto, la presente solicitud divulga polipéptidos recombinantes sustancialmente purificados que comprenden la fórmula general X-SEC ID Nº : 2, donde X es un polipéptido detectable. El polipéptido detectable puede seleccionarse del grupo que consiste en polipéptidos fluorescentes y miembros polipeptídicos de un par de unión. En otro aspecto, la solicitud divulgada proporciona ácidos nucleicos sustancialmente purificados que codifican los polipéptidos de este segundo aspecto de la solicitud.

En un tercer aspecto, la presente solicitud divulga ácidos nucleicos sustancialmente purificados que codifican un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 2 (GPBP de 91 kD) . Los ácidos nucleicos 45 sustancialmente purificados pueden consistir en el ácido nucleico de SEC ID Nº : 1, o un producto de ARNm del mismo.

En un cuarto aspecto, la presente solicitud divulga vectores de expresión recombinante que comprenden el ácido nucleico sustancialmente purificado de cualquier aspecto de la solicitud.

En un quinto aspecto, la presente solicitud divulga células hospedadoras transfectadas con un vector de expresión recombinante de la solicitud.

En un sexto aspecto, la presente solicitud divulga un polipéptido sustancialmente purificado que comprende la 55 secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 2 (GPBP de 91 kD) o SEC ID Nº : 4 (GPBP de 77 kD) , donde el polipéptido de SEC ID Nº : 2 o SEC ID Nº : 4 comprende una o más modificaciones post-traduccionales (MTP) que implican directa y/o indirectamente a los restos de aminoácidos de 305-344 GGPDYEEGPNSLINEEEFFDAVEAALDRQDKIEEQSQSEK (SEC ID Nº : 10) (numeración basada en la posición dentro de la GPBP de 77 kD) . Una o más de las MTP puede comprender MTP covalentes. Una o más de las MTP puede comprender las MTP covalentes dentro de los aminoácidos de 305-344 (SEC ID Nº : 10) . Una o más de las MTP puede implicar directa o indirectamente a los restos 320-327 (EEFFDAVE, SEC ID Nº : 5) . Una o más de las MTP puede comprender una o más de las MTP covalentes dentro de los restos de 320-327 (EEFFDAVE, SEC ID Nº : 5) . El polipéptido sustancialmente purificado puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 2 (GPBP de 91kD) o SEC ID Nº : 4 (GPBP de 77kD) .

En un séptimo aspecto, la presente solicitud divulga polipéptidos sustancialmente purificados que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 2 (GPBP de 91 kD) o SEC ID Nº : 4 (GPBP de 77 kD) , donde el polipéptido de SEC ID Nº : 2 o SEC ID Nº : 4 comprende una o más MTP que implican directa y/o indirectamente a los restos de 371-396, PYSRSSSMSSIDLVSASDDVHRFSSQ (SEC ID Nº : 9) (numeración basada en las posiciones dentro de la 5 GPBP de 77 kD) . Una o más de las MTP puede comprender MTP covalentes. Una o más de las MTP puede comprender MTP covalentes dentro de los aminoácidos de 371-396 (SEC ID Nº : 9) . Una o más de las MTP puede implicar directa o indirectamente a los restos de 388-392 (DDVHR, SEC ID Nº : 6) . Una o más de las MTP puede comprender una o más de las MTP covalentes dentro de los restos de 388-392 (SEC ID Nº : 6) . El polipéptido puede comprender adicionalmente una o más de las MTP que implican directa y/o indirectamente a los restos de aminoácidos de 305-344 GGPDYEEGPNSLINEEEFFDAVEAALDRQDKIEEQSQSEK (SEC ID Nº : 10) (numeración basada en la posición dentro de la GPBP de 77 kD) ; preferentemente una o más de las MTP comprende MTP covalentes, e incluso más preferentemente una o más de las MTP comprende las MTP covalentes dentro de los aminoácidos de 305-344 (SEC ID Nº : 10) . Una o más de las MTP puede implicar directa o indirectamente a los restos de 320-327 (EEFFDAVE, SEC ID Nº : 5) . Una o más de las MTP puede comprender una o más de las MTP

covalentes dentro de los restos de 320-327 (EEFFDAVE, SEC ID Nº : 5) . El polipéptido sustancialmente purificado puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 2 (GPBP de 91 kD) o SEC ID Nº : 4 (GPBP de 77 kD) .

En un octavo aspecto, la presente solicitud divulga anticuerpos monoclonales sustancialmente purificados que se unen selectivamente a un polipéptido del sexto o del séptimo aspecto de la solicitud.

En un noveno aspecto, la presente solicitud divulga anticuerpos monoclonales sustancialmente purificados que se unen específicamente al polipéptido de SEC ID Nº : 2 y no al polipéptido de SEC ID Nº : 4. El anticuerpo monoclonal puede unirse a un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos DGWKGRLPSPLVLLPRSARC (SEC ID Nº : 7) .

En un décimo aspecto, la presente solicitud divulga métodos para detectar la proteína de unión al antígeno de Goodpasture (GPBP) en la circulación, que comprenden:

(a) poner en contacto una muestra de plasma con una molécula de unión a GPBP en condiciones que promuevan la unión selectiva de la molécula de unión a GPBP a la GPBP;

(b) retirar las moléculas de unión a GPBP no unidas; y

(c) detectar la formación de complejos entre la molécula de unión a GPBP y la GPBP en la muestra de plasma.

En un undécimo aspecto, la presente solicitud divulga métodos para detectar la proteína de unión al antígeno de 35 Goodpasture (GPBP) en la orina, que comprenden:

(a) poner en contacto una muestra de orina con una molécula de unión a GPBP en condiciones que promuevan la unión selectiva de la molécula de unión a GPBP a la GPBP;

(b) retirar las moléculas de unión a GPBP no unidas; y

(c) detectar la formación de complejos entre la molécula de unión a GPBP y la GPBP en la muestra de orina.

En un duodécimo aspecto, la presente solicitud divulga métodos para aislar la GPBP nativa de 77 kD, que comprenden:

(a) someter a una muestra de plasma a una precipitación con sulfato de amonio;

(b) llevar a cabo una cromatografía de intercambio iónico (CII) en la muestra de suero precipitada con sulfato de amonio;

(c) identificar las fracciones de la CII que contienen la GPBP nativa de 77 kD;

(d) someter a las fracciones de la CII que contienen a la GPBP de 77 kD nativa a cromatografía de filtración en gel (CFG) ; y

(e) identificar las fracciones de la CFG que contienen la GPBP nativa de 77 kD.

En un decimotercer aspecto, la presente solicitud... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Uso de una molécula de unión a la proteína de unión al antígeno de Goodpasture (GPBP) para detectar la GPBP de 77 kDa en una muestra de plasma, donde la molécula de unión a GPBP es un anticuerpo, un aptámero o un sustrato de GPBP.

2. El uso de la reivindicación 1, donde el plasma es un suero sanguíneo al que se le han retirado los factores de coagulación.

3. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicha molécula de unión a GPBP es un anticuerpo monoclonal.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicha isoforma de GPBP de 77 kDa es la isoforma nativa de GPBP de 77 kDa.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicha muestra de plasma o suero se obtiene de un sujeto humano que se sospecha que tiene una afección inmunitaria seleccionada del grupo que consiste en Síndrome de Goodpasture y glomerulonefritis mediada por complejo inmunitario.

6. El uso de la reivindicación 5, para diagnosticar que el sujeto humano tiene una enfermedad autoinmunitaria seleccionada del grupo que consiste en Síndrome de Goodpasture y glomerulonefritis mediada por complejo inmunitario, donde un aumento en el sujeto de la GPBP de 77 kD respecto al control es indicativo de Síndrome de Goodpasture o glomerulonefritis mediada por complejo inmunitario.

7. Un método para detectar en la circulación la proteína de unión al antígeno de Goodpasture (GPBP) , que comprende

(a) poner en contacto una muestra de plasma con una molécula de unión a GPBP que se une a la GPBP en condiciones que promueven la unión selectiva de la molécula de unión a GPBP a la GPBP, donde la molécula de unión a GPBP es un anticuerpo, un aptámero o un sustrato de GPBP;

(b) retirar las moléculas de unión a GPBP no unidas; y

(c) detectar la formación de complejos entre la molécula de unión a GPBP y la GPBP en la muestra de plasma.

8. El método de la reivindicación 7 donde la molécula de unión a GPBP comprende un anticuerpo.

9. Un método para aislar isoformas nativas de GPBP, que comprende un método seleccionado del grupo que consiste en:

(I)

(a) someter a una muestra de plasma a una precipitación con sulfato de amonio;

(b) llevar a cabo una cromatografía de intercambio iónico (CII) en la muestra de plasma precipitada con sulfato de amonio;

(c) identificar las fracciones de la CII que contienen isoformas nativas de GPBP;

(d) someter a las fracciones de la CII que contienen isoformas nativas de GPBP a cromatografía de filtración en gel (CFG) ; y

(e) identificar las fracciones de la CFG que contienen isoformas nativas de GPBP; y

(II)

(a) pasar una muestra de plasma a través de una columna de afinidad que comprende una molécula de unión a GPBP que se une selectivamente a la GPBP nativa, donde la molécula de unión a GPBP es un anticuerpo, un aptámero o un sustrato de GPBP;

(b) lavar la proteína no unida de la muestra de plasma de la columna de afinidad; y

(c) eluir las isoformas nativas de GPBP de la columna.


 

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