Proceso SMB para producir EPA altamente puro de aceite de pescado.

Un proceso de separación cromatográfica para recuperar un producto de ácido graso poliinsaturado (PUFA) de una mezcla de alimentación que es un aceite de pescado o que se deriva de aceite de pescado,

proceso que comprende las etapas de:

(i) purificar la mezcla de alimentación en una etapa de separación cromatográfica, para obtener un primer producto intermedio; y

(ii) purificar el primer producto intermedio obtenido en (i) en una etapa de separación cromatográfica en lecho móvil simulado o real, para obtener un segundo producto intermedio; y

(iii) purificar el segundo producto intermedio obtenido en (ii) en una etapa de separación cromatográfica en lecho móvil simulado o real, para obtener el producto de PUFA; en el que

un disolvente orgánico acuoso se usa como eluyente en cada etapa de separación; ácidos grasos saturados y/o monoinsaturados presentes en la mezcla de alimentación se extraen en la primera etapa de separación;

el producto de PUFA se separa de los diferentes componentes de la mezcla de alimentación en las etapas (ii) y (iii); y

el producto de PUFA obtenido en la tercera etapa de separación contiene ácido eicosapentaenoico (EPA) o un derivado de EPA en una cantidad superior al 90 % en peso.

Proceso SMB para producir EPA attamente puro de aceite de pescado

La presente invención se refiere a un proceso de separación cromatogràfica mejorado para purificar ei ácido graso poiiinsaturado EPA o un derivado dei mismo.

EPA y sus derivados son precursores para moiécuias bioiógicamente importantes, que desempeñan una función importante en !a reguiación de funciones bioiógicas taies como !a agregación de piaquetas, infamación y respuestas inmunoiógicas. Así, EPA y sus deñvados pueden ser terapéuticamente útiies en e! tratamiento de una ampüa variedad de afecciones patoiógicas que ¡nciuyen afecciones de! SNC; neuropatías, que ¡nciuyen neuropatía diabética; enfermedades cardíovascuiares; afecciones dei sistema inmunitaño generai e infamatorias, que ¡nciuyen enfermedades infamatoñas de ¡a píe!.

Se encuentra EPA en materiales de partida naturales, y en particuiar aceites de pescado. Ei EPA en ¡os aceites de pescado está, sin embargo, presente en taies aceites en mezcia con ácidos grasos saturados y numerosas otras impurezas.

La puñf cación de EPA de aceites de pescado es particuiarmente exigente. Así, ios aceites de pescado son mezclas extremadamente compiejas que contienen un gran número de diferentes componentes con tiempos de retención muy simiiares en aparatos de cromatografía. Representan una mateña pñma mucho más exigente de ¡a que puñficar EPA que, por ejempio, una materia pñma de aceite de aigas. Sin embargo, se requiere un grado de pureza muy aito de EPA, particuiarmente para aplicaciones farmacéuticas y nutracéuticas. Por tanto, históñcamente, se ha usado destiiación para puñf car EPA para aplicaciones terapéuticas.

Desafortunadamente, EPA es extremadamente frágii. Así, cuando se caiienta en presencia de oxígeno, tiene tendencia a isomerización, peroxidación y oiigomerización. Por tanto, ei fraccionamiento y puñfcación de EPA para preparar ácidos grasos puros es difícil. La destiiación, inciuso a vacío, puede conducir a degradación de productos no aceptable.

La cromatografía en lecho móvü simulado o reai son técnicas conocidas, comunes para aquellos expeños en ¡a mateña. El principio de operación impiica e! movimiento en contracorñente de una fase de eiuyente iíquido y una fase de adsorbente sólido. Esta operación permite e! uso mínimo de disoivente, haciendo el proceso económicamente viable. Tal tecnología de separación ha encontrado vañas aplicaciones en diversas áreas, que incluyen hidrocarburos, productos químicos industriales, aceites, azúcares y API.

Como es muy sabido, en un sistema cromatográfco de ¡echo estacionado convencional, una mezcla cuyos componentes van a separarse pernota a través de un recipiente. El recipiente es generalmente cilíndñco, y normalmente se denomina columna. La coiumna contiene un refeno de un mateña! poroso (generalmente llamado la fase estacionaria) que presenta una aita permeabilidad a ¡os fuidos. La velocidad de percolación de cada componente de la mezcla depende de ¡as propiedades físicas de ese componente, de manera que los componentes salen de la columna sucesivamente y selectivamente. Así, algunos de los componentes tienden a fijarse fueñemente a la fase estacionaria y así pernotarán tentamente, mientras que otros tienden a fijarse débilmente y salir de la columna más rápidamente. Se han propuesto muchos sistemas cromatográfcos de lecho estacionario diferentes y se usan para tanto fines anatíticos como de producción ¡ndustñat.

A diferencia, un aparato de cromatografía de techo móv¡! simulado consiste en varias columnas individuales que contienen adsorbente que están conectadas juntas en señe. Se pasa eiuyente a través de las columnas en una primera dirección. Los puntos de inyección de ¡a mateña pñma y el eiuyente, y los puntos de recogida de los componentes separados en e! sistema, se desplazan periódicamente por medio de una señe de válvulas. El efecto gioba! es simuiar ¡a operación de una única coiumna que contiene un lecho móvil de adsorbente sólido, moviéndose e! adsorbente sóüdo en una dirección en contracorriente a! fujo de eiuyente. Así, un sistema de lecho móvil simulado consiste en columnas que, como en un sistema de ¡echo estacionado convencional, contienen lechos estacionarios de adsorbente sóüdo a través de ¡os cuates pasa e! eiuyente, pero en un sistema de lecho móvil simulado ¡a operación es ta! que se simula un ¡echo móv¡! en contracorñente continuo.

Los procesos y equipo para ¡a cromatografía en ¡echo móv¡! simulado se describen en vañas patentes, que ¡nciuyen ¡os documentos US 2.985.589, US 3.696.107, US 3.706.812, US 3.761.533, FR-A-2103302, FR-A-2651148 y FR-A- 2651149. E! tópico también se trata en detaüe en "Preparative and Production Scale Chromatography ", editado por Ganetsos y Barker, Marce! Dekker !nc, New York, 1993.

E! documento US-A-5719302 descñbe procesos para e! fraccionamiento cromatográfco de composiciones que comprenden ácidos grasos poüinsaturados o deñvados de los mismos.

Un sistema de ¡echo móv¡! rea! es simüar en operación a un sistema de lecho móvil simulado. Sin embargo, en vez de desplazar los puntos de inyección de ¡a mezcla de alimentación y el eiuyente, y los puntos de recogida de ¡os

componentes separados por medio de un sistema de válvulas, en su lugar se mueven físicamente una serie de unidades de adsorción (es decir, columnas) con respecto a los puntos de alimentación y descarga. De nuevo, la operación es tal que se simula un lecho móvil en contracorriente continuo.

Los procesos y equipo para la cromatografía en lecho móvil real se describen en varias patentes, que incluyen los documentos US 6.979.402, US 5.069.883 y US 4.764.276.

Un aparato de cromatografía en lecho móvil simulado típico se ilustra con referencia a la Figura 1. El concepto de un proceso de separación cromatográfica en lecho móvil simulado o real se explica considerando una columna cromatográfica vertical que contiene la fase estacionaria S dividida en secciones, más precisamente en cuatro subzonas superpuestas I, II, III y IV desde el fondo hasta la cabeza de la columna. El eluyente se introduce en el fondo en IE por medio de una bomba P. La mezcla de los componentes A y B que van a separarse se introduce en IA + B entre la sub-zona II y la sub-zona III. Un extracto que contiene principalmente B se recoge en SB entre la sub-zona I y la sub-zona II, y un refinado que contiene principalmente A se recoge en SA entre la sub-zona III y la sub-zona IV.

En el caso de un sistema de lecho móvil simulado, se produce un movimiento descendente simulado de la fase estacionaria S por movimiento de los puntos de introducción y recogida con respecto a la fase sólida. En el caso de un sistema de lecho móvil real, el movimiento descendente simulado de la fase estacionarla S se produce por movimiento de las diversas columnas cromatográficas con respecto a los puntos de Introducción y recogida. En la Figura 1, el eluyente circula hacia arriba y la mezcla A + B se Inyecta entre la sub-zona II y la sub-zona III. Los componentes se moverán según sus interacciones cromatográficas con la fase estacionarla, por ejemplo, adsorción sobre un medio poroso. El componente B que presenta afinidad más fuerte con la fase estacionarla (el componente que eluye más lento) será más lentamente arrastrado por el eluyente y lo seguirá con retraso. El componente A que presenta afinidad más débil con la fase estacionarla (el componente que eluye más rápido) será más fácilmente arrastrado por el eluyente. Si el conjunto adecuado de parámetros, especialmente la velocidad de flujo en cada sub- zona, están correctamente estimados y controlados, el componente A que presenta la afinidad más débil con la fase estacionaria se recogerá entre la sub-zona III y la sub-zona IV como un refinado y el componente B que presenta la afinidad más fuerte con la fase estacionarla se recogerá entre la sub-zona I y la sub-zona II como un extracto.

Para lograr EPA de alta pureza o éster etílico de EPA en purezas superiores al 90 %, por ejemplo, superiores al 95 o 97 %, es posible utilizar un proceso de separación en lecho móvil simulado que realiza dos etapas de separación simultáneas. Un proceso tal se describe en la solicitud de patente internacional n° PCT/GB10/002339.

En general, todas las técnicas cromatográficas de separación para separar PUFA, que incluyen procesos SMB, utilizan grandes volúmenes de disolventes orgánicos como eluyentes. Después de completarse el proceso de separación cromatográfica, los PUFA deben recuperarse de la disolución en el eluyente. Normalmente, un gran gasto de tiempo y energía participa en la recuperación de PUFA de la disolución... [Seguir leyendo]

1. Un proceso de separación cromatográfica para recuperar un producto de ácido graso poliinsaturado (PUFA) de una mezcla de alimentación que es un aceite de pescado o que se deriva de aceite de pescado, proceso que comprende las etapas de:

(i) purificar la mezcla de alimentación en una etapa de separación cromatográfica, para obtener un primer producto intermedio; y

(ii) purificar el primer producto intermedio obtenido en (i) en una etapa de separación cromatográfica en lecho móvil simulado o real, para obtener un segundo producto intermedio; y

(iii) purificar el segundo producto intermedio obtenido en (¡i) en una etapa de separación cromatográfica en lecho móvil simulado o real, para obtener el producto de PUFA; en el que

un disolvente orgánico acuoso se usa como eluyente en cada etapa de separación; ácidos grasos saturados y/o monoinsaturados presentes en la mezcla de alimentación se extraen en la primera etapa de separación; el producto de PUFA se separa de los diferentes componentes de la mezcla de alimentación en las etapas (¡i) y

(¡¡i); y

el producto de PUFA obtenido en la tercera etapa de separación contiene ácido eicosapentaenoico (EPA) o un derivado de EPA en una cantidad superior al 90 % en peso.

2. Un proceso según la reivindicación 1, en el que

(I) la primera etapa de separación comprende purificar la mezcla de alimentación en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real; y en el que la primera, segunda y tercera etapas de separación se llevan a cabo simultáneamente en un único aparato de cromatografía en lecho simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatografía conectadas que contienen, como eluyente, un disolvente orgánico acuoso, llevándose a cabo la primera, segunda y tercera etapas de separación en la primera, segunda y tercera zonas, respectivamente, en el que cada zona tiene uno o más puntos de inyección para una corriente de mezcla de alimentación, uno o más puntos de inyección para agua y/o disolvente orgánico, una corriente de descarga de refinado de la que puede recogerse líquido de dicha zona y una corriente de descarga de extracto de la que puede recogerse líquido de dicha zona; o

(II) la primera etapa de separación comprende purificar la mezcla de alimentación en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real; y en el que la primera y segunda etapas de separación se llevan a cabo simultáneamente en un único aparato de cromatografía en lecho simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatografía conectadas que contienen, como eluyente, un disolvente orgánico acuoso, llevándose a cabo la primera y segunda etapas de separación en la primera y segunda zonas, respectivamente, en el que cada zona es como se define en (I) anteriormente, y en el que la tercera etapa de separación se lleva a cabo en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real separado; o

(III) la primera etapa de separación comprende purificar la mezcla de alimentación en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real; y en el que la segunda y tercera etapas de separación se llevan a cabo simultáneamente en un único aparato de cromatografía en lecho simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatografía conectadas que contienen, como eluyente, un disolvente orgánico acuoso, llevándose a cabo la segunda y tercera etapas de separación en la primera y segunda zonas, respectivamente, en el que cada zona es como se define en (I) anteriormente, y en el que la primera etapa de separación se lleva a cabo en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real separado; o

(IV) la primera etapa de separación comprende purificar la mezcla de alimentación en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real; y en el que

(a) la primera, segunda y tercera etapas de separación se llevan a cabo secuencialmente en el mismo aparato de cromatografía, recuperándose el primer y segundo productos intermedios entre la primera y segunda, y segunda y tercera etapas de separación, respectivamente, y ajustándose las condiciones de proceso en el aparato de cromatografía entre la primera y segunda, y segunda y tercera etapas de separación de forma que los ácidos grasos saturados y/o monoinsaturados presentes en la mezcla de alimentación se extraigan en la primera etapa de separación y el producto de PUFA se separe de los diferentes componentes de la mezcla de alimentación en las etapas (¡i) y (i¡¡); o

(b) la segunda etapa de separación se lleva a cabo usando un aparato cromatográfico diferente al usado en la primera etapa de separación, y/o la tercera etapa de separación se lleva a cabo usando un aparato cromatográfico diferente al usado en la segunda etapa de separación; o

(V) la primera etapa de separación comprende purificar la mezcla de alimentación en un aparato de cromatografía en lecho estacionario; y en el que

(a) la segunda y tercera etapas de separación se llevan a cabo simultáneamente en un único aparato de cromatografía en lecho simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatografía conectadas que contienen, como eluyente, un disolvente orgánico acuoso, llevándose a cabo la segunda y tercera etapas de separación en la primera y segunda zonas, respectivamente, en el que cada zona es como se define en (I) anteriormente; o

(b) la segunda y tercera etapas de separación se llevan a cabo secuencialmente en el mismo aparato de cromatografía, recuperándose el segundo producto intermedio entre la segunda y tercera etapas de separación y ajustándose las condiciones de proceso en el aparato de cromatografía entre la segunda y tercera etapas de separación de forma que el producto de PUFA se separe de los diferentes componentes de la mezcla de alimentación en las etapas (¡i) y (iii); o

(c) la segunda y tercera etapas de separación se llevan a cabo en aparatos de cromatografía separados respectivamente, introduciéndose el producto intermedio obtenido de la segunda etapa de separación en el aparato de cromatografía usado en la tercera etapa de separación.

3. Un proceso según la reivindicación 2, en el que en los aparatos de cromatografía en lecho simulado o real en los que se llevan a cabo simultáneamente dos etapas de separación en dos zonas, una corriente de refinado o de extracto se recoge de una columna en la primera zona y se introduce a una columna no adyacente en la segunda

zona; y/o

en el que en los aparatos de cromatografía en lecho simulado o real en los que se llevan a cabo simultáneamente tres etapas de separación en tres zonas, una corriente de refinado o de extracto se recoge de una columna en la primera zona y se introduce a una columna no adyacente en la segunda zona, y una corriente de refinado o de extracto se recoge de una columna en la segunda zona y se introduce a una columna no adyacente en la tercera zona.

4. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que (a) la primera etapa de separación comprende purificar la mezcla de alimentación en un aparato de cromatografía en lecho estacionario o en lecho simulado o real; y/o

(b) el primer producto intermedio obtenido en la primera etapa de separación está enriquecido en el producto de PUFA en comparación con la mezcla de alimentación; y el segundo producto Intermedio obtenido en la segunda etapa de separación está enriquecido en el producto de PUFA en comparación con el primer producto intermedio; y/o

(c) en la primera etapa el producto de PUFA se separa de componentes de la mezcla de alimentación que son menos polares que el producto de PUFA, en la segunda etapa el producto de PUFA se separa de componentes de la mezcla de alimentación que son menos polares que el producto de PUFA, pero más polares que los componentes separados en la primera etapa de separación, y en la tercera etapa de separación el producto de PUFA se separa de componentes más polares de la mezcla de alimentación; y/o

(d) los componentes separados del producto de PUFA en la segunda etapa de separación incluyen ácido docosahexaenoico (DFIA) o un derivado de DFIA y/u otros PUFA o derivados de PUFA que son menos polares que el producto de PUFA; y/o los componentes separados del producto de PUFA en la tercera etapa de separación incluyen ácido estearidónico (SDA) o un derivado de SDA y/u otros PUFA que son más polares que el producto de PUFA.

5. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que

(a) el segundo producto intermedio se recoge como corriente de refinado en la segunda etapa de separación y el producto de PUFA se recoge como corriente de extracto en la tercera etapa de separación, y

en el que la primera etapa de separación comprende preferentemente purificar la mezcla de alimentación en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real, y en el que el primer producto intermedio se recoge preferentemente como corriente de refinado en la primera etapa de separación; y/o

(b) el eluyente es una mezcla de agua y un alcohol, un éter, un áster, una cetona o un nitrito, y en el que el eluyente es preferentemente una mezcla de agua y metano!; y/o

(c) el producto de PUFA contiene EPA o un derivado de EPA en una cantidad superior al 95 % en peso, preferentemente el 97 % en peso; y/o

(d) el derivado de EPA es áster etílico (EE) de EPA.

6. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que

- parte de la corriente de extracto del aparato usado en la segunda etapa de separación se recircula de nuevo al aparato usado en la segunda etapa de separación; y/o

- parte de la corriente de refinado del aparato usado en la segunda etapa de separación se recircula de nuevo al aparato usado en la segunda etapa de separación; y/o

- parte de la corriente de extracto del aparato usado en la tercera etapa de separación se recircula de nuevo al aparato usado en la tercera etapa de separación; y/o

- parte de la corriente de refinado del aparato usado en la tercera etapa de separación se recircula de nuevo al aparato usado en la tercera etapa de separación.

7. Un proceso según la reivindicación 6, en el que la primera etapa de separación comprende purificar la mezcla de alimentación en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real, y en el que

- parte de la corriente de extracto del aparato usado en la primera etapa de separación se recircula de nuevo al

aparato usado en la primera etapa de separación; y/o

- parte de la corriente de refinado del aparato usado en la primera etapa de separación se recircula de nuevo al aparato usado en la primera etapa de separación.

8. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la relación de agua:disolvente orgánico usado en cada etapa de separación se ajusta de forma que los ácidos grasos saturados y/o monoinsaturados presentes en la mezcla de alimentación se extraigan en la primera etapa de separación; y

el producto de PUFA se separe de los diferentes componentes de la mezcla de alimentación en las etapas (¡i) y (i¡¡).

9. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que el eluyente de disolvente orgánico acuoso usado en cada etapa de separación tiene una relación de agua:disolvente orgánico diferente.

10. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el eluyente de disolvente orgánico acuoso usado en la segunda y tercera etapas de separación tiene la misma relación de agua:disolvente orgánico y el eluyente de disolvente orgánico acuoso usado en la primera etapa de separación tiene una relación de agua:disolvente orgánico diferente del eluyente de disolvente orgánico usado en la segunda y tercera etapas de separación.

11. Un proceso según la reivindicación 10, en el que (a) la relación de agua:disolvente orgánico dei eiuyente de disolvente orgánico acuoso usado en la primera etapa de separación es menor que la reiación de agua:disoivente orgánico del eluyente de disolvente orgánico acuoso usado en la segunda y tercera etapas de separación, y

en el que la relación de agua:disolvente orgánico del eluyente usada en ia primera etapa de separación es preferentemente del 0,1:99,9 al 1:99 % en peso, y la relación de agua:disoivente orgánico dei eiuyente usada en ia segunda y tercera etapas de separación es preferentemente del 7:93 ai 9:91 % en peso; o

(b) la primera etapa de separación comprende purificar ia mezcia de aiimentación en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real, y en el que la tasa a ia que ei iíquido recogido mediante una o ambas de las corrientes de extracto y de refinado en la primera etapa de separación se recircuia de nuevo ai aparato usado en esa etapa de separación se ajusta de forma que los ácidos grasos saturados y/o monoinsaturados presentes en la mezcla de alimentación se extraigan en la primera etapa de separación y ei producto de PUFA se separe de los diferentes componentes de la mezcla de alimentación en las etapas (¡i) y (i¡¡).

12. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en ei que (a) la tasa a la que el líquido recogido mediante una o ambas de las corrientes de extracto y de refinado en ia segunda etapa de separación se recircula de nuevo al aparato usado en esa etapa de separación se ajusta de forma que ios ácidos grasos saturados y/o monoinsaturados presentes en la mezcla de alimentación se extraigan en ia primera etapa de separación y el producto de PUFA se separe de los diferentes componentes de ia mezcla de alimentación en las etapas (¡i) y (i¡¡); y/o en el que la tasa a la que el líquido recogido mediante una o ambas de ias corrientes de extracto y de refinado en la tercera etapa de separación se recircula de nuevo al aparato usado en esa etapa de separación se ajusta de forma que los ácidos grasos saturados y/o monoinsaturados presentes en ia mezcla de alimentación se extraigan en la primera etapa de separación y el producto de PUFA se separe de los diferentes componentes de la mezcla de alimentación en las etapas (ii) y (i¡¡); y/o

(b) la tasa a la que el líquido recogido mediante la corriente de extracto en ia segunda etapa de separación se recircula de nuevo al aparato de cromatografía usado en la segunda etapa de separación se diferencia de ia tasa a la que el líquido recogido mediante la corriente de extracto en ia tercera etapa de separación se recircuia de nuevo al aparato de cromatografía usado en la tercera etapa de separación; y/o

(c) la primera etapa de separación comprende purificar ia mezcla de alimentación en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real, y en el que la tasa a la que el líquido recogido mediante ia corriente de extracto en la primera etapa de separación se recircula de nuevo al aparato de cromatografía usado en la primera etapa de separación se diferencia de la tasa a la que el líquido recogido mediante ia corriente de extracto en la segunda etapa de separación se recircuia de nuevo al aparato de cromatografía usado en la segunda etapa de separación; y/o

(d) la tasa a la que el líquido recogido mediante la corriente de extracto en ia segunda etapa de separación se recircula de nuevo al aparato cromatogràfico usado en la segunda etapa de separación es más rápida que ia tasa a la que el líquido recogido mediante la corriente de extracto en ia tercera etapa de separación se recircuia de nuevo al aparato cromatogràfico usado en la tercera etapa de separación.

13. Un proceso según la reivindicación 1, en el que el eluyente es una mezcla de agua y metano! y en el que:

- la primera etapa de separación comprende purificar la mezcla de alimentación en un aparato de cromatografía en lecho simulado o real;

- la segunda y tercera etapas de separación se llevan a cabo simultáneamente en un único aparato de cromatografía en lecho simulado o real que tiene una pluralidad de columnas de cromatografía conectadas que contienen, como eluyente, un disolvente orgánico acuoso, llevándose a cabo la segunda y tercera etapas de separación en la primera y segunda zonas, respectivamente, en el que cada zona es como se define en la

reivindicación 2(i), y en ei que ia primera etapa de separación se iieva a cabo en un aparato de cromatografía en iecho simulado o reai separado;

- ei primer producto intermedio se recoge como corriente de refinado en ia primera etapa de separación, ei segundo producto intermedio se recoge como corriente de refinado en ia segunda etapa de separación y ei

5 producto de PUFA se recoge como corriente de extracto en ia tercera etapa de separación;

- ia segunda corriente intermedia de refinado que contiene ei producto de PUFA junto con componentes más potares se recoge de una columna en ¡a primera zona y se introduce en una coiumna no adyacente en ¡a segunda zona;

- ei eiuyente de disolvente orgánico acuoso usado en ¡a segunda y tercera etapas de separación tiene ¡a misma

10 reiación de agua:disolvente orgánico, y ¡a relación de agua:disolvente orgánico dei eiuyente usada en ¡a

primera etapa de separación es menor que ¡a reiación de agua:disolvente orgánico dei eiuyente usada en ¡a segunda y tercera etapas de separación; y

- ia tasa a ia que el iíquido recogido mediante ¡a corriente de extracto en ia segunda etapa de separación se recircuia de nuevo a! aparato cromatográfico usado en ¡a segunda etapa de separación es más rápida que ¡a

15 tasa a ia que ei iíquido recogido mediante ¡a corriente de extracto en ¡a tercera etapa de separación se recircula

de nuevo ai aparato cromatográfico usado en la tercera etapa de separación.

14. Un programa informático para controiar un aparato de cromatografía como se define en una cuaiquiera de ias reivindicaciones 1 a 13, programa informático que contiene medios de código que, cuando se ejecuta, ordena ai 20 aparato iievar a cabo un proceso según una cualquiera de ias reivindicaciones 1 a 13.