Procedimiento de genotipado.

Un procedimiento de genotipado de N loci en una molécula de ácido nucleico diana presente en una muestra,

en el que N es al menos 1 y cada locus se localiza en una región marcadora del genotipo correspondiente de la molécula de ácido nucleico y corresponde a dos o más genotipos, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) realizar una preamplificación de cada región marcadora del genotipo usando reacciones enzimáticas dependientes del cebador, en el que la amplificación se realiza con un primer grupo de pares de cebadores de amplificación que consiste en un primer conjunto de uno o más cebadores directos y un primer conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes, dando uno o más amplicones que abarcan la o las regiones marcadoras del genotipo, y en el que cada amplicón contiene una región con al menos una secuencia de nucleótidos que puede actuar como una diana de unión al cebador distinta de la región marcadora del genotipo;

b) realizar el o los amplicones de la etapa a) una reacción de amplificación de ácido nucleico a dos niveles usando reacciones enzimáticas dependientes del cebador, en el que

b1) el primer nivel es la amplificación de ácido nucleico usando un segundo grupo de pares de cebadores que se unen a cada amplicón producido en la etapa a), en el que dicho grupo de pares de cebadorES consiste en un segundo conjunto de uno más cebadores directos diferentes y un segundo conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes, en el que cada variante de secuencia de cada locus está dirigido por al menos un cebador de dichos segundos conjuntos de cebadores; formando dicho al menos un cebador un conjunto de cebadores de selección, siendo los cebadores de selección bipartitos que tienen en el extremo 3' una parte de secuencia de reconocimiento del que se une a dichos N loci en la región marcadora del genotipo, y en el extremo 5' una parte de la secuencia marcadora de una pieza artificial que es específica de genotipo o una parte de la secuencia marcadora de dos piezas artificial específica, una pieza de las cuales es específica del genotipo y la otra no es específica del genotipo, y en el que cada cebador de selección que se une al locus diana de la región marcadora de genotipo forma un par de cebadores junto con otro cebador perteneciente a dichos segundos conjuntos de cebadores pero apuntando hacia dicha secuencia de nucleótidos que puede actuar como diana de unión al cebador de la etapa a), y en el que cada cebador de selección está presente en una concentración de menos de 100 nM, preferentemente 10-0,01 nM, y lo más preferido de aproximadamente 0,3 nM, y el otro cebador de dicho par de cebadores está presente a una concentración al menos 100 veces, preferentemente entre 100 y 100 000 veces la de dicho cebador de selección, dando amplicones cada uno de los cuales contiene uno correspondiente de dichos N loci; b2) el segundo nivel es amplificación de ácido nucleico usando un tercer grupo de pares de cebadores que se unen a cada amplicón producido en la etapa b1), en el que dicho grupo de pares de cebadores, presentes en una concentración de al menos 100 veces, preferentemente entre 100 y 100 000 veces la de dichos cebadores de selección en la etapa b1), consiste en un tercer conjunto de uno o más cebadores directos diferentes y un tercer conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes, en el que cada parte de la secuencia de marcaje de cada cebador de selección está marcado por el menos un cebador de dicho tercer conjunto de cebadores, formando dicho al menos un conjunto de cebadores de detección, y en el que cada cebador de detección que se une a la parte de la secuencia de marcaje forma un par de cebadores junto con otro cebador que pertenece a dicho tercer conjunto de cebadores pero dirigido a dicha secuencia de nucleótidos que puede actuar como diana de unión del cebador de la etapa a), teniendo los cebadores de detección:

i) una secuencia específica de genotipo correspondiente a la parte de la secuencia de marcaje de una pieza artificial de los cebadores de selección, en el que cada cebador de detección está marcado con un marcador detectable específico de genotipo; o

ii) una secuencia no específica de genotipo que es común a todos los cebadores de detección y corresponde a la secuencia no específica de la parte de la secuencia de marcaje de dos piezas artificial de los cebadores de selección, en el que cada cebador de detección está marcado opcionalmente en el extremo 5' con un marcador detectable o un resto químico;

que tiene como resultado amplicones detectables, cada uno de los cuales contiene uno respectivo de dichos N loci marcados con secuencias de marcaje específicas de genotipo y, opcionalmente, marcadores específicos de genotipo;

c), el genotipado de dichos N loci de la molécula de ácido nucleico diana mediante:

c1) detección durante, o después de, la amplificación de la misma cada marcador comprendido en cada amplicón producido en la etapa b2i), y relacionando la cantidad predominante de marcador detectado con un genotipo específico para cada locus; o c2) después de la amplificación poner en contacto cada amplicón producido en la etapa b2ii) con una matriz de detección de secuencias específicas de genotipo, detectar la hibridación de cada amplicón a la matriz y relacionar la hibridación detectada con un genotipo específico para cada locus.

Procedimiento de genotipado Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para genotipar uno o más loci en una molécula diana presente en una muestra. Adicionalmente, la invención se refiere a un kit para realizar dicho procedimiento. La invención también se refiere a un procedimiento para diseñar y producir cebadores de selección para su uso en dicho procedimiento de genotipado o en dicho kit. Asimismo, la invención se refiere a la selección de cebadores como tales.

Antecedentes

En investigación genética o en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, una tarea importante es la determinación y la clasificación de las secuencias de nucleótidos en una región concreta del genoma en la que entra en dos categorías, que gobiernan características importantes del fenotipo. El principal ejemplo de una situación de este tipo es el sitio de escisión de la proteína precursora de hemaglutinina (HAO) del virus de la gripe aviar (VGA), que es de un tipo característico de un virus poco o muy patogénico. Los sitios de escisión de HAP del VGA altamente patogénico contienen varias cadenas laterales de aminoácidos básicos con el motivo mínimo R/K-X-R/K- RjG y hasta ahora solo se han encontrado para los subtipos H5 y H71. De hecho, se ha demostrado que un gran número de virus posen proteínas de superficie para las que se requiere escisión postraduccional para la activación de la infectividad2, incluyendo importantes patógenos tales como el virus de la inmunodeficiencia de tipo 1, los filovirus ébola y Marburg y flavivirus, tal como el virus de la fiebre amarilla. Muchos de estos virus poseen motivos del sitio de escisión similares a los de los virus de la gripe aviar y hay varios virus para los que se ha demostrado que existen correlaciones entre las propiedades de patogenicidad y de escisión1,2

En base a la representación de codones, el motivo del sitio de escisión del VGA altamente patogénico puede estar representado por más de 18. secuencias distintas a nivel del ARN. Varios cientos de estas posibles secuencias se han descubierto en diferentes virus de los subtipos H5 y H7 y constantemente están apareciendo nuevos virus con secuencias del sitio de escisión antes desconocidas. Por esta razón, los intentos para sondar el sitio de escisión en aplicaciones de PCR se han limitado a subpoblaciones de virus de la gripe3"6 y los procedimientos estándar actuales para el análisis molecular de la patogenicidad del VGA implican la secuenciación de los nucleótidos del sitio de escisión3,7 Por tanto, los experimentos en un solo tubo para el patotipado del VGA, que eviten una secuenciación de nucleótidos engorrosa, que requiere tiempo y técnicamente exigente, para aplicaciones diagnósticas y de detección selectiva rápidas, deben poder investigar la muestra de un modo multiplexado.

Un problema importante de la diferenciación de grupos grandes de secuencias genómicas es la concepción de procedimientos de amplificación multiplexados8 para obtener una amplificación homogénea de todos los segmentos diana reconocidos y suprimir las interacciones entre los cebadores.

Se han realizado intentos para suprimir interacciones entre los cebadores, por ejemplo, usando la tecnología HANDS (sistema no dimérico asistido por marcadores Homo), en la que los cebadores quiméricos (cebadores de reconocimiento de secuencia marcados con una secuencia universal) están presentes a una concentración relativamente baja, mientras que los cebadores universales dirigidos al complemento de los marcadores universales presentes en los cebadores quiméricos, que en este esquema lleva eficazmente la amplificación a niveles detectables, están a concentraciones más altas9. Dado que las mismas secuencias de marcadores universales extienden el cebador directo e inverso de cada par de cebadores quiméricos, los extremos de los productos de amplificación serán autocomplementarios tras unos pocos ciclos de PCR. En resumen, apuntando a los productos de dimerización de cebadores independientes favorecerá la formación de estructuras de "trípode" intramoleculares, lo que protegerá el extremo 3' y evitará la amplificación posterior de los dímeros cebadores9. La supresión de los dímeros cebadores permitirá mayor multiplexación.

En un esquema relacionado1, que adapta el concepto de supresión en la PCR 11 para detección multiplexada, un cebador universal diana (adaptador) se une a los extremos del ADN genómico. La amplificación multiplexada se consigue usando un cebador, común a todas las reacciones multiplexadas, apuntando a la región del adaptador y un cebador específico diana para cada reacción de componentes multiplexada. Se han propuesto dos mecanismos para explicar la eficiencia de multiplexación archivada con este procedimiento1. En primer lugar, la reducción del número de cebadores usados en la reacción, dado que el cebador adaptador es idéntico para todas las reacciones, reducir las interacciones indeseadas del cebador. En segundo lugar, la falsa amplificación realizada por el cebador adaptador solo producirá amplicones con extremos autocomplementarios y, por tanto, formará estructuras en trípode cuya amplificación posterior se suprimirá del mismo modo que se ha propuesto para los dímeros cebadores en el procedimiento HANDS9

Posteriormente, el uso de cebadores universales ha encontrado muchos usos en procedimientos multiplexados, tales como PCR potenciada12, Templex PCR13, PCR de recorrido anidada14, pero también en procedimientos de amplificación multiplexada basados en unión, tales como amplificación con sondas dependiente de la unión15 y ensayos basados en sondas de inversión moleculares marcadas de secuencia 16

El procedimiento para PCR multiplex, que puede facilitar el genotipado de microsatélites basado en fluorescencia (SSR) y la preparación multiplex de moldes de ADN para ensayos de SNP, se describe en Hayden et al, "Multiplex- Ready PCR: A new method for multlplexed SSR and SNP genotyping", BMC Genomics, vol. 9, n° 1,28.

A pesar de los esfuerzos realizados en la técnica, todavía existe la necesidad de nuevos procedimientos que proporcionen una amplificación homogénea de todos los segmentos diana reconocidos en grupos grandes de secuencias genómicas.

Sumario de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento nuevo que aborde el problema mencionado anteriormente de la diferenciación de grupos grandes de secuencias genómicas combinando varios de los temas descritos anteriormente de una forma nueva.

De acuerdo con la invención, la diferenciación de la invención de grupos grandes de secuencias genómicas se consigue mediante un procedimiento semianidado que comprende preamplificación y una reacción de amplificación de dos niveles, que desacopla los acontecimientos de reconocimiento y detección.

La invención se refiere, en un aspecto, a un procedimiento de genotipado de los N loci presentes en una muestra en una molécula de ácido nucleico diana, en el que cada locus se localiza en una región marcadora del genotipo de la molécula de ácido nucleico y corresponde a dos o más genotipos.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un kit para realizar dicho procedimiento de genotipado, que comprende cebadores y, opcionalmente, otros ingredientes de una mezcla de reacción de amplificación de ácido nucleico.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para diseñar y producir cebadores de selección para usar en el procedimiento de genotipado o en el kit para realizar el procedimiento de genotipado.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a cebadores de selección adaptados para el genotipado de loci en una molécula de ácido nucleico diana.

Otras ventajas y objetos de la presente invención se describirán con más detalle, entre otras cosas, con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el resumen de una realización de la etapa de preamplificación a) del procedimiento de genotipado, en el que algunos cebadores están marcados con una secuencia artificial.

La figura 2 muestra el resumen de una realización de la etapa b) del procedimiento de genotipado, en el que un locus se va a genotipar correspondiente a cuatro genotipos. Los cebadores de selección (cebadores directos) son bipartitos con una parte secuencia de reconocimiento del locus (1) y una parte de secuencia de mareaje de dos piezas artificial en la que una pieza es una secuencia específica de genotipo (2) compuesta por ADN libre de estructura para hibridación en matrices y la otra pieza es una secuencia no específica de genotipo (3) común a todos los cebadores de selección bipartitos. El cebador... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de genotipado de N loci en una molécula de ácido nucleico diana presente en una muestra, en el que N es al menos 1 y cada locus se localiza en una región marcadora del genotipo correspondiente de la molécula de ácido nucleico y corresponde a dos o más genotipos, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) realizar una preampllflcaclón de cada región marcadora del genotipo usando reacciones enzimáticas dependientes del cebador, en el que la amplificación se realiza con un primer grupo de pares de cebadores de amplificación que consiste en un primer conjunto de uno o más cebadores directos y un primer conjunto de uno o más cebadores Inversos diferentes, dando uno o más amplicones que abarcan la o las regiones marcadoras del genotipo, y en el que cada amplicón contiene una región con al menos una secuencia de nucleótldos que puede actuar como una diana de unión al cebador distinta de la región marcadora del genotipo;

b) realizar el o los amplicones de la etapa a) una reacción de amplificación de ácido nucleico a dos niveles usando reacciones enzimáticas dependientes del cebador, en el que

b1) el primer nivel es la amplificación de ácido nucleico usando un segundo grupo de pares de cebadores que se unen a cada amplicón producido en la etapa a), en el que dicho grupo de pares de cebadorES consiste en un segundo conjunto de uno más cebadores directos diferentes y un segundo conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes, en el que cada variante de secuencia de cada locus está dirigido por al menos un cebador de dichos segundos conjuntos de cebadores; formando dicho al menos un cebador un conjunto de cebadores de selección, siendo los cebadores de selección bipartitos que tienen en el extremo 3' una parte de secuencia de reconocimiento del que se une a dichos N loci en la región marcadora del genotipo, y en el extremo 5' una parte de la secuencia marcadora de una pieza artificial que es específica de genotipo o una parte de la secuencia marcadora de dos piezas artificial específica, una pieza de las cuales es específica del genotipo y la otra no es específica del genotipo, y en el que cada cebador de selección que se une al locus diana de la reglón marcadora de genotipo forma un par de cebadores junto con otro cebador perteneciente a dichos segundos conjuntos de cebadores pero apuntando hacia dicha secuencia de nucleótldos que puede actuar como diana de unión al cebador de la etapa a), y en el que cada cebador de selección está presente en una concentración de menos de 1 nM, preferentemente 1-,1 nM, y lo más preferido de aproximadamente ,3 nM, y el otro cebador de dicho par de cebadores está presente a una concentración al menos 1 veces, preferentemente entre 1 y 1 veces la de dicho cebador de selección, dando amplicones cada uno de los cuales contiene uno correspondiente de dichos N loci; b2) el segundo nivel es amplificación de ácido nucleico usando un tercer grupo de pares de cebadores que se unen a cada amplicón producido en la etapa b1), en el que dicho grupo de pares de cebadores, presentes en una concentración de al menos 1 veces, preferentemente entre 1 y 1 veces la de dichos cebadores de selección en la etapa b1), consiste en un tercer conjunto de uno o más cebadores directos diferentes y un tercer conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes, en el que cada parte de la secuencia de mareaje de cada cebador de selección está marcado por el menos un cebador de dicho tercer conjunto de cebadores, formando dicho al menos un conjunto de cebadores de detección, y en el que cada cebador de detección que se une a la parte de la secuencia de mareaje forma un par de cebadores junto con otro cebador que pertenece a dicho tercer conjunto de cebadores pero dirigido a dicha secuencia de nucleótldos que puede actuar como diana de unión del cebador de la etapa a), teniendo los cebadores de detección:

I) una secuencia específica de genotipo correspondiente a la parte de la secuencia de mareaje de una pieza artificial de los cebadores de selección, en el que cada cebador de detección está marcado con un marcador detectable específico de genotipo; o

ii) una secuencia no específica de genotipo que es común a todos los cebadores de detección y corresponde a la secuencia no específica de la parte de la secuencia de mareaje de dos piezas artificial de los cebadores de selección, en el que cada cebador de detección está marcado opcionalmente en el extremo 5' con un marcador detectable o un resto químico;

que tiene como resultado amplicones detectables, cada uno de los cuales contiene uno respectivo de dichos N loci marcados con secuencias de mareaje específicas de genotipo y, opclonalmente, marcadores específicos de genotipo;

c) , el genotipado de dichos N loci de la molécula de ácido nucleico diana mediante:

c1) detección durante, o después de, la amplificación de la misma cada marcador comprendido en cada amplicón producido en la etapa b2i), y relacionando la cantidad predominante de marcador detectado con un genotipo específico para cada locus; o c2) después de la amplificación poner en contacto cada amplicón producido en la etapa b2ii) con una matriz de detección de secuencias específicas de

genotipo, detectar la hibridación de cada amplicón a la matriz y relacionar la hibridación detectada con un genotipo específico para cada locus.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos que puede actuar como diana de unión al cebador de la etapa a) pertenece a un conjunto de secuencias que tienen menos de 1 miembros, preferentemente menos de 2 miembros y más preferido 1-5 miembros, y/o corresponde a una parte de mareaje de secuencia artificial introducida en los amplicones formados en la etapa a) por medio de dicho primer conjunto de cebadores, en el que dichos cebadores son bipartitos y comprenden una secuencia de mareaje en 5' artificial y una región en 3' de unión a la molécula de ácido nucleico diana y/o corresponde a una región o regiones genómicas.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que los cebadores de selección y de detección tienen secuencias seleccionadas para minimizar la interacción cebador-cebador, preferentemente en el que la parte de la secuencia de mareaje artificial de dichos cebadores tiene extremos autocomplementarios para formar menos de 1 pares de bases, preferentemente de 3-7 pares de bases y lo más preferido 5 pares de bases.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho tercer conjunto de cebadores usado en la etapa b2) que se unen a al menos una secuencia que puede actuar como una diana de unión al cebador de la etapa a) es el mismo que dicho segundo conjunto de cebadores usados en la etapa b1) que se unen a la al menos una secuencia que puede actuar como una diana de unión al cebador de la etapa a).

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho segundo conjunto de cebadores usado en la etapa b1) que se unen a al menos una secuencia que puede actuar como una diana de unión al cebador de la etapa a) es el mismo que el primer conjunto de cebadores usados en la etapa a).

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que cada locus corresponde a dos genotipos, opcionalmente en el que la presencia o ausencia de un locus determinado indica resistencia y no resistencia antimicrobiana, respectivamente, de un microorganismo.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que los dos genotipos para cada locus indican

patogenicidad alta y baja, respectivamente., de un microorganismo cuyo genoma contiene el locus,

preferentemente en el que el microorganismo es un virus de la gripe.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que los dos genotipos corresponden a la presencia o ausencia de un locus, opcionalmente en el que la presencia o ausencia de un locus determinado indica resistencia y no resistencia antimicrobiana, respectivamente, de un microorganismo.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el par de cebadores de la

etapa a) consiste en cebadores que comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEC ID N° 59 y 58 o de

cebadores que comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEC ID N° 57 y 56, o de cebadores que

comprenden las secuencias de ácido nucleico de la tabla 7 o seleccionadas de las secuencias de ácido

nucleico de la tabla 4 y/o en el que dichos cebadores de selección se eligen de oligonucleótidos que

comprenden las secuencias de SEC ID N° 1 a 55, o se eligen de oligonucleótidos que comprenden las

secuencias de la tabla 3 o la tabla 6 y/o en el que dichos cebadores de detección se eligen de oligonucleótidos que comprenden las secuencias de SEC ID N° 6 y 61.

1. Unkit para realizar el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un primer grupo de pares de cebadores que consiste en un primer conjunto de uno o más cebadores directos diferentes y un primer conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes para la realización de la etapa de preamplificación a) de la reivindicación 1 un segundo grupo de pares de cebadores que consiste en un segundo conjunto de uno o más cebadores directos diferentes y un segundo conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes, un segundo conjunto de los cuales forma un conjunto de cebadores de selección, en el que los cebadores de selección son bipartitos y tienen en el extremo 3' una secuencia de reconocimiento del locus y en el extremo 5' una parte de la secuencia de mareaje de una pieza artificial que es específica del genotipo o una parte de la secuencia de mareaje de dos piezas artificial, siendo una pieza de las mismas específica del genotipo y siendo la otra no específica del genotipo, para la realización de la amplificación de primer nivel de la etapa b1) de la reivindicación 1; un tercer grupo de pares de cebadores que consiste en un tercer conjunto de uno o más cebadores directos diferentes y un tercer conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes, un tercer conjunto del cual forma un conjunto de cebadores de detección, en el que los cebadores de detección tienen una secuencia específica del genotipo correspondiente a la parte de la secuencia de mareaje de una pieza artificial de los cebadores de selección o una secuencia no específica del genotipo común a cada cebador de detección y correspondiente a la secuencia no específica de la parte de la secuencia de mareaje de dos piezas artificial de los cebadores de selección, para la realización de la amplificación de segundo nivel de la etapa b2) de la reivindicación 1, en el que los cebadores de detección

están marcados opcionalmente en el extremo 5' con un marcador o un resto químico y, opcionalmente, otros ingredientes de una mezcla de reacción de amplificación de ácido nucleico.

11. El kit de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los cebadores de selección y de detección tienen secuencias seleccionadas para minimizar la interacción cebador-cebador, preferentemente en el que los extremos de dichos cebadores son autocomplementarios para formar menos de 1,más preferentemente 3-7 pares de bases y lo más preferido 5 pares de bases.

12. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho tercer conjunto de cebadores directos es el mismo que dicho segundo conjunto de cebadores directos o dicho tercer conjunto de cebadores inversos es el mismo que dicho segundo conjunto de cebadores inversos.

13. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho segundo conjunto de cebadores directos es el mismo que primer conjunto de cebadores directos o dicho segundo conjunto de cebadores inversos es el mismo que dicho primer conjunto de cebadores inversos.

14. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el primer conjunto de cebadores comprende las SEC ID N° 59 y 58 o las secuencias de SEC ID N°: 57 y 56, o de cebadores que comprenden las secuencias de ácido nucleico de la tabla 7 o seleccionadas de las secuencias de ácido nucleico de la tabla 4 y/o en el que dichos cebadores de selección se eligen de oligonucleótidos que comprenden las secuencias de SEC ID N° 1 a 55, o se eligen de oligonucleótidos que comprenden las secuencias de la tabla 3 o la tabla 6 y/o en el que dichos cebadores de detección se eligen de oligonucleótidos que comprenden las secuencias de SEC ID N° 6 y 61.

15. Un procedimiento para diseñar y producir cebadores de selección que se van a usar en el procedimiento para el genotipado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o en el kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, comprendiendo las etapas de:

a) seleccionar una región altamente variable en la que las secuencias son tan diferentes como sea posible entre diferentes genotipos:

b) alinear un gran número de secuencias de molécula de ácido nucleico de interés, que comprenden al menos un locus;

c) combinar las moléculas de ácido nucleico alineadas por medio de un programa informático con función de alineación del perfil;

d) recortar las moléculas de ácido nucleico alineadas a los oligonucleótidos que tienen entre 2 y 5 nucleótidos, preferentemente entre 3 y 4 nucleótidos, más preferido 35 oligonucleótidos, que cubren dicho locus;

e) ajustar la longitud de dichos oligonucleótidos de la etapa d), mientras que todavía cubre dicho locus, para alcanzar temperaturas de fusión similares para todos los oligonucleótidos citados, estando las temperaturas de fusión en un intervalo de aproximadamente 1 °C preferentemente en 5 °C, más preferido en 1 °C;

f) agrupar dichos oligonucleótidos en cebadores degenerados;

g) sintetizar dichos cebadores degenerados al tiempo que se añaden al extremo 5' de los cebadores una parte de la secuencia de mareaje de una pieza artificial que es específica de genotipo o una parte de la secuencia de mareaje de dos piezas artificial, siendo una pieza de las mismas específica del genotipo y siendo la otra no específica del genotipo;

h) recuperar el producto del cebador de selección de la etapa g);

en el que dicha parte de la secuencia de mareaje artificial tiene una secuencia seleccionada para minimizar la interacción cebador-cebador, en la que los extremos de dichos cebadores son autocomplementarios para formar menos de 1, preferentemente 3-7 y lo más preferido 5 pares de bases.

16. Un conjunto de pares de cebadores adecuados para llevar a cabo las etapas del procedimiento de la reivindicación 1, que comprende los cebadores de selección adaptados para el genotipado de loci en una molécula de ácido nucleico diana, en el que cada locus se localiza en una región marcadora del genotipo de la molécula de ácido nucleico y corresponde a dos o más genotipos, en el que dichos cebadores de selección comprenden en el extremo 3' una parte de la secuencia de reconocimiento del locus y en el extremo 5' una parte de la secuencia de mareaje de una pieza artificial o una parte de la secuencia de mareaje de dos piezas artificial, una pieza de las cuales es específica del genotipo y la otra es no específica del genotipo, elegidas de los oligonucleótidos que comprenden las secuencias de SEC ID N° 1 a 55, o se eligen de los oligonucleótidos que comprenden las secuencias de la tabla 3 o la tabla 6.