Procedimiento para preparar una composición de IgG enriquecida a partir de plasma.

Un procedimiento que comprende las etapas de:

(a) precipitar una fracción de plasma desprovisto de crioprecipitado,

en una primera etapa de precipitación, con alcohol entre aproximadamente un 6 % y aproximadamente un 10 % a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3 para obtener un sobrenadante enriquecido en IgG;

(b) precipitar la IgG del sobrenadante con alcohol entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 30 % a una temperatura inferior y a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3 para formar un primer precipitado;

(c) resuspender el primer precipitado formado en la etapa (b) para formar una suspensión;

(d) tratar la suspensión formada en la etapa (c) con un detergente,

(e) precipitar la IgG de la suspensión con alcohol entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 30 % a un pH de entre aproximadamente 6,7 y aproximadamente 7,3 para formar un segundo precipitado;

(f) resuspender el segundo precipitado formado en la etapa (e) para formar una suspensión;

(g) tratar la suspensión formada en la etapa (f) con un disolvente y/o detergente; y

(h) realizar al menos un fraccionamiento por cromatografía de intercambio iónico preparando así una composición de IgG concentrada,

en el que el procedimiento comprende además tratar la suspensión formada en la etapa (c) con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido y filtrar la solución antes de la etapa (d).

Procedimiento para preparar una composición de IgG enriquecida a partir de plasma

Antecedentes de la invención 5

Los productos de inmunoglobulina de plasma humano se usaron por primera vez en 1952 para tratar una inmunodeficiencia. Inicialmente, la administración intramuscular o subcutánea del isotipo G de inmunoglobulina (IgG) eran los procedimientos de elección. Sin embargo, para inyectar mayores cantidades de IgG necesarias para un tratamiento eficaz de varias enfermedades, se desarrollaron los productos administrables por vía intravenosa con 10 menor concentración de IgG (50 mg/ml) . Normalmente, la inmunoglobulina intravenosa (IVIG) , contiene las inmunoglobulinas de inmunoglobulina G (IgG) combinadas del plasma de más de mil donantes de sangre. Típicamente, contienen más de un 95 % de IgG no modificada, que tiene las funciones efectoras dependientes de Fc intactas, y solo cantidades mínimas de inmunoglobulina A (IgA) o inmunoglobulina M (IgM) , las IVIG son productos de IgG purificados, estériles, usados principalmente en el tratamiento de tres categorías principales de afecciones 15 médicas: (1) inmunodeficiencias tales como agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, hipogammaglobulinemia (inmunodeficiencias primarias) , y afecciones de inmunidad deficiente adquirida (inmunodeficiencias secundarias) , con niveles de anticuerpos bajos; (2) enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias; y (3) infecciones agudas.

Específicamente, muchas personas con trastornos de inmunodeficiencia primaria carecen de anticuerpos necesarios 20 para resistir la infección. En determinados casos, estas deficiencias se pueden complementar por la infusión de IgG purificada, comúnmente a través de administración intravenosa (es decir, tratamiento con IVIG) . Varios trastornos de inmunodeficiencia primaria se tratan comúnmente de esta manera, incluyendo agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA) , inmunodeficiencia variable común (CVID) , síndrome hiper-IgM (HIM) , inmunodeficiencia combinada grave (SCID) , y algunas deficiencias de la subclase de IgG (Blaese y Winkelstein, J. Patient & Family 25 Handbook for Primar y Immunodeficiency Diseases. Towson, MD: Immune Deficiency Foundation; 2007) .

Aunque el tratamiento con IVIG puede ser muy eficaz para tratar trastornos de inmunodeficiencia primaria, este tratamiento solo es una sustitución temporal para los anticuerpos que no se producen en el cuerpo, más que una cura para la enfermedad. En consecuencia, los pacientes dependientes del tratamiento con IVIG requieren dosis 30 repetidas, típicamente, de aproximadamente una vez al mes de por vida. Esta necesidad supone una gran demanda de una producción continuada de composiciones de IVIG. Sin embargo, a diferencia de otros productos biológicos que se producen por medio de la expresión in vitro de vectores de ADN recombinante, la IVIG se fracciona a partir de donantes de sangre y plasma humanos. Por lo tanto, no se pueden incrementar los productos de IVIG incrementando simplemente el volumen de producción. Más bien el nivel de IVIG disponible comercialmente está 35 limitado por el suministro disponible de donaciones de sangre y plasma.

Varios factores impulsan la demanda de IVIG, incluyendo la aceptación de tratamientos con IVIG, la identificación de indicaciones adicionales para las que el tratamiento con IVIG es eficaz, y el incremento del diagnóstico del paciente y la prescripción de IVIG. Notablemente, la demanda global de IVIG se ha más que cuadriplicado desde 1990 y 40 continúa incrementándose en la actualidad a una tasa anual de entre aproximadamente un 7 % y un 10 % (Robert P., Pharmaceutical Policy and Law, 11 (2009) 359-367) . Por ejemplo, la Australian National Blood Authority informó de que la demanda de IVIG en Australia creció un 10, 6 % durante el año presupuestario 2008-2009 (National Blood Authority Australia Annual Report 2008-2009) .

Debido en parte al incremento de la demanda global y de las fluctuaciones en el suministro disponible de productos de inmunoglobulina, varios países, incluyendo Australia e Inglaterra, han implementado programas de gestión de la demanda para proteger los suministros de estos productos para los pacientes con la mayor demanda durante épocas de escasez de productos.

Se ha informado de que en 2007, se fraccionaron 26, 5 millones de litros de plasma, generando 75, 2 toneladas métricas de IVIG, con un promedio del rendimiento de producción de 2, 8 gramos por litro (Robert P., supra) . Este mismo informe estimó que se esperaba que los rendimientos globales de IVIG se incrementaran aproximadamente 3, 43 gramos por litro en 2012. Sin embargo, debido al crecimiento continuado de la demanda global de IVIG, extrapolada entre aproximadamente un 7 % y un 13 % anual entre ahora y el 2015, se necesitará una mejora 55 adicional en el rendimiento de IVIG total para cumplir con la demanda global.

Se usan varios procedimientos de preparación de IVIG por proveedores comerciales de los productos de IVIG. Un problema común con los procedimientos de producción de IVIG actuales es la pérdida sustancial de IgG durante el procedimiento de purificación, que se estima que es al menos de un 30 % a un 35 % del contenido de IgG total del 60 material de partida. Un reto es mantener la calidad de la inactivación vírica y la falta de impurezas que puedan provocar reacciones adversas, reforzando mientras el rendimiento de IgG. En los niveles de producción actuales de IVIG, lo que se considera pequeños incrementos en el rendimiento son, de hecho, altamente significativos. Por ejemplo, en los niveles de producción en 2007, un incremento de un 2 % en la eficacia, igual a 56 miligramos adicionales por litro, generarían 1, 5 toneladas métricas adicionales de IVIG. 65

En la cuarta entrega de una serie de artículos influyentes publicados sobre la preparación y las propiedades de las proteínas del suero y del plasma, Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc., 1946, 68 (3) : 459-475) describieron por primera vez un procedimiento para el fraccionamiento con alcohol de proteínas del plasma (procedimiento 6) , que permite el aislamiento de una fracción enriquecida en IgG a partir de plasma humano. Varios años después, Oncley et al. (J. Am. Chem. Soc., 1949, 71 (2) : 541-550) ampliaron los procedimientos de Cohn publicando un procedimiento 5 (procedimiento 9) que dio como resultado el aislamiento de una preparación de IgG más pura.

Estos procedimientos, aunque sientan las bases para toda la industria de los factores sanguíneos derivados de plasma, no pudieron proporcionar preparaciones de IgG que tuvieran concentraciones suficientemente altas para el tratamiento de varias enfermedades inmunorrelacionadas, incluyendo síndrome de Kawasaki, púrpura 10 trombocitopénica inmunitaria e inmunodeficiencias primarias. Como tales, se desarrollaron metodologías adicionales que empleaban varias técnicas, tales como cromatografía de intercambio iónico, para proporcionar formulaciones de IgG con mayor pureza y mayor concentración. Hoppe et al. (Munch Med Wochenschr 1967 (34) : 1749-1752) y Falksveden (patente sueca n.º 348942) y Falksveden y Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980) fueron entre los primeros en emplear la cromatografía de intercambio iónico con este propósito. 15

Varios procedimientos modernos emplean una etapa de precipitación, tal como precipitación con caprilato (Lebing et al., Vox Sang 2003 (84) :193-201) y precipitación con etanol de la fracción (I+) II+III de Cohn (Tanaka et al., Braz J Med Biol Res 2000 (33) 37-30) acoplada a cromatografía en columna. Más recientemente, Teschner et al. (Vox Sang, 2007 (92) :42-55) han descrito un procedimiento para la producción de un producto de IVIG al 10 % en el que, en 20 primer lugar, se retira el crioprecipitado de los plasmas combinados y, a continuación, se realiza un fraccionamiento con etanol frío de Cohn-Oncley modificado, seguido del tratamiento S/D del intermedio, cromatografía de intercambio iónico, nanofiltración, y opcionalmente ultrafiltración/diafiltración.

Los documentos DE10008619, EP0893450, US4550019, US6159471, US4499073 tratan sobre la purificación y 25 preparación de preparaciones de anticuerpos/IgG (es decir, inmunoglobulina) .

Sin embargo, a pesar de la mejora en pureza, seguridad y rendimiento proporcionados por estos procedimientos de fabricación de IgG, aún se pierde una cantidad significativa de IgG durante el procedimiento de fabricación. Por ejemplo, Teschner et al. informaron de que su procedimiento da como resultado un incremento en el rendimiento de 30 IgG de un 65 % (Teschner et al., supra) . Tal como se informó durante varias reuniones sobre productos de plasma, el promedio de los rendimientos para la preparación a gran escala de IgG, tales como... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento que comprende las etapas de:

(a) precipitar una fracción de plasma desprovisto de crioprecipitado, en una primera etapa de precipitación, con 5 alcohol entre aproximadamente un 6 % y aproximadamente un 10 % a un pH de entre aproximadamente 6, 7 y aproximadamente 7, 3 para obtener un sobrenadante enriquecido en IgG;

(b) precipitar la IgG del sobrenadante con alcohol entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 30 % a una temperatura inferior y a un pH de entre aproximadamente 6, 7 y aproximadamente 7, 3 para formar un primer 10 precipitado;

(c) resuspender el primer precipitado formado en la etapa (b) para formar una suspensión;

(d) tratar la suspensión formada en la etapa (c) con un detergente, 15

(e) precipitar la IgG de la suspensión con alcohol entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 30 % a un pH de entre aproximadamente 6, 7 y aproximadamente 7, 3 para formar un segundo precipitado;

(f) resuspender el segundo precipitado formado en la etapa (e) para formar una suspensión; 20

(g) tratar la suspensión formada en la etapa (f) con un disolvente y/o detergente; y

(h) realizar al menos un fraccionamiento por cromatografía de intercambio iónico preparando así una composición de IgG concentrada, 25

en el que el procedimiento comprende además tratar la suspensión formada en la etapa (c) con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido y filtrar la solución antes de la etapa (d) .

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en la etapa (b) , antes de o concomitante con la adición de 30 alcohol, se enfría la solución hasta

(i) entre aproximadamente -7 ºC y aproximadamente -9 ºC, o hasta

(ii) una temperatura de o de aproximadamente -7 ºC. 35

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la concentración de alcohol de la etapa (b) está

(i) entre aproximadamente un 23 % y aproximadamente un 27 %, o 40

(ii) entre aproximadamente un 24 % y aproximadamente un 26 %, o

(iii) es de o de aproximadamente un 25 %.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la etapa (b) , tras completarse la 45 adición de alcohol, se ajusta inmediatamente el pH de la solución a

(i) entre aproximadamente 6, 8 y aproximadamente 7, 0, o

(ii) a o a aproximadamente 6, 9. 50

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se mantiene el pH de la solución

(i) a entre aproximadamente 6, 8 y aproximadamente 7, 0, o 55

(ii) a aproximadamente 6, 9

de manera continua durante el periodo de incubación de precipitación de la etapa (b) .

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se usa un tampón de extracción frío 60 en la etapa (c) para resuspender el precipitado a una proporción de

(i) 1 parte de precipitado con respecto a 15 partes de tampón de extracción, o a proporciones de

(ii) desde aproximadamente 1:8 hasta aproximadamente 1:30, o 65

(iii) desde aproximadamente 1:10 hasta aproximadamente 1:20, o

(iv) desde aproximadamente 1:12 hasta aproximadamente 1:18, o

(v) desde aproximadamente 1:13 hasta aproximadamente 1:17, o 5

(vi) desde aproximadamente 1:14 hasta aproximadamente 1:16.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el tampón de extracción tiene un pH de entre aproximadamente 4, 0 y aproximadamente 5, 5. 10

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el tampón de extracción contiene fosfato de sodio monobásico 5 mM, acetato 5 mM y ácido acético glacial de un 0, 051 % a un 0, 06 % (v/v) .

9. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, en el que el tampón de extracción contiene fosfato de sodio 15 monobásico 5 mM y acetato 5 mM a un pH de o de aproximadamente 4, 5 +- 0, 2 y una conductividad de o de aproximadamente 0, 7 a 0, 9 mS/cm.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido es sílice de combustión. 20

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el tratamiento con sílice de combustión incluye la adición de desde aproximadamente 0, 1 kg/kg de pasta de II-III hasta aproximadamente 0, 07 kg/kg de pasta de II+III, o desde aproximadamente 0, 2 kg/kg de pasta de II-III hasta aproximadamente 0, 06 kg/kg de pasta de II+III, o desde aproximadamente 0, 3 kg/kg de pasta de II-III hasta aproximadamente 0, 05 kg/kg de pasta de II+III, o de 25 aproximadamente 0, 2, 0, 3, 0, 4, 0, 5, 0, 6 o 0, 7 kg/kg de pasta de II+III, y se incuba la mezcla durante entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 70 minutos, o aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 o más minutos a una temperatura de entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el tratamiento con sílice de combustión comprende un 30 periodo de incubación de 40 a 80 minutos durante el cual se mezcla constantemente la suspensión.

13. El procedimiento de la reivindicación 10 o 12, en el que el tratamiento con sílice de combustión se realiza a entre aproximadamente 0 ºC y aproximadamente 10 ºC, o entre aproximadamente 2 ºC y aproximadamente 8 ºC.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el filtrado de la solución antes de la etapa (d) usa una filtración de profundidad.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, que comprende además lavar el filtro de profundidad con entre aproximadamente 3, 5 volúmenes y aproximadamente 4, 5 volúmenes, o aproximadamente 2, 5, 2, 6, 2, 7, 2, 8, 2, 9, 3, 0, 40 3, 1, 3, 2, 3, 3, 3, 4, 3, 5, 3, 6, 3, 7, 3, 8, 3, 9, 4, 0, 4, 1, 4, 2, 4, 3, 4, 4, 4, 5, 4, 6, 4, 7, 4, 8, 4, 9, 5, 0 volúmenes del volumen muerto del filtro tras completarse la etapa de filtración.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que una o más de las etapas de precipitación (a) , (b) y (e) se realizan mediante la adición por pulverización de alcohol. 45

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 16, en el que se ajusta continuamente el pH de una solución durante una o más de las etapas de precipitación con alcohol (a) , (b) y (e) .

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que se ajusta el pH de una o más 50 soluciones mediante adición de un agente modificador de pH mediante pulverización.