Procedimiento para la predicción de cirrosis hepática alcohólica no vírica en un sujeto.

La presente invención es un procedimiento para la predicción de cirrosis hepática no vírica en un sujeto,

que comprende la detección de la presencia del gen KIR2DS5 en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, la comparación del resultado de la detección anterior con un control y la evaluación de su predisposición genética a desarrollar cirrosis hepática no vírica a partir de la comparación anterior. El método resulta una herramienta muy útil para definir un factor de riesgo que permite predecir si un sujeto que consuma alcohol va a tener una respuesta inmunitaria inadecuada para protegerle frente al desarrollo de fibrosis y su deriva hacia cirrosis alcohólica no asociada infección viral.

PROCEDIMIENTO PARA LA PREDICCIÓN DE CIRROSIS HEPÁTICA ALCOHÓLICA NO VÍRICA EN UN SUJETO

SECTOR TÉCNICO 5

La invención se encuadra en el campo médico del diagnóstico y pronóstico de cirrosis alcohólica en pacientes humanos con hábito etanólico sin infección viral concomitante, asociado a la prevención de la enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los genes de los receptores de células asesinas naturales (NK) semejantes a inmunoglobulina (KIR) han sido recientemente relacionados con la respuesta al trasplante de médula ósea, asignándoles un papel en el efecto anti-leucémico (Babor F, Fischer JC, Uhrberg M. "The role of KIR genes and ligands in leukemia 15 surveillance". Front Immunol. 2013. 7; 4:27) . También, con algunos tipos de trasplante de órganos y con la predisposición a padecer infecciones por virus de la hepatitis C o enfermedades autoinmunitarias (Zhou H et al., "Donor selection for killer immunoglobulin-like receptors B haplotype of the centromeric motifs can improve the outcome after HLA-identical sibling hematopoietic stem cell transplantation". Biol Blood 20 Marrow Transplant. 2014; 20 (1) :98-105) .

KIR son un grupo de receptores de membrana codificados por una familia de genes polimórficos situados dentro del Complejo de Receptores Leucocitarios (LCR) del cromosoma 19. Estos genes codifican receptores de membrana con función tanto de 25 inhibidores como activadores. Se expresan en la superficie de las células NK y en subpoblaciones de linfocitos T y T. Los receptores KIR modulan la actividad de las células NK o T a través de la interacción con sus ligandos específicos que son las moléculas de HLA de clase I (Vilches C et al. "Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 2007; 70 (5) :415-30 22) .

El gen activador KIR2DS5 ha sido recientemente relacionado con la susceptibilidad a artritis reumatoide (Chandran V et al. "Killer-cell immunoglobulin-like receptor gene polymorphisms and susceptibility to psoriatic arthritis". Rheumatology (Oxford) . 2014; 35

(2) :233-9, en contraposición con la protección frente a la trombocitopenia de origen inmunitario. No existe en la técnica un ligando conocido para los receptores codificados por este gen (Nowak I et al. "Does the KIR2DS5 gene protect from some human diseases?" PLoS One. 2010.26;5 (8) . Tampoco se han relacionado los genes KIR con el hábito etanólico que lleva a desarrollar cirrosis alcohólica. 5

La ingesta mantenida de alcohol en el tiempo tiene como consecuencia la aparición de fibrosis hepática, que precede a una cirrosis. Si en esta etapa fibrótica el paciente deja de tomar alcohol el hígado pone en marcha distintos mecanismos de regeneración, mientras que si el consumo persiste el proceso se cronifica y sólo puede 10 ser tratado mediante trasplante hepático. En definitiva el daño hepático por alcohol sólo se puede revertir con la abstención etanólica en las etapas iniciales. En la actualidad, la cirrosis alcohólica se diagnostica por la anamnesis y declaración del paciente sobre consumo habitual de alcohol, exploración física, pruebas bioquímicas (bilirrubina, AST/ALT, GGT, etc.) , por pruebas de imagen (Fibroscan) y sobre todo por 15 biopsia hepática como método de referencia para determinar el grado de fibrosis. El gran inconveniente de la biopsia es que es una técnica de carácter invasivo. Todas estas técnicas sirven únicamente para el diagnóstico una vez establecida la cirrosis y ninguna supone un factor precoz de riesgo que pueda ser aprovechado para prevenir la enfermedad. 20

Por el contrario, el método de la presente invención sí identifica KIR2DS5 como un factor de riesgo para la susceptibilidad a la cirrosis alcohólica no asociada a virus, cuya detección puede ser usada para recomendar la abstención etanólica.

La hepatitis por virus C puede también conducir a cirrosis, pero en este caso el diagnóstico se realiza por la presencia del virus y la cuantificación de la carga viral mediante inmunoensayo. Este método no es aplicable al diagnóstico de cirrosis alcohólica no infectada por virus. En algunos pacientes la cirrosis por virus C se asocia también al consumo de alcohol pero no con KIR2DS5. Así pues, la presente invención 30 sirve para discriminar ambos tipos de cirrosis precisamente porque KIR2DS5 no reasocia a cirrosis alcohólica producida por infección viral sino que es un factor altamente asociado a la cirrosis puramente alcohólica sin infección viral concomitante, como se muestra en la presente solicitud.

El problema de la técnica es encontrar un biomarcador de cirrosis hepática alcohólica no asociada a virus, con valor predictivo fiable y detección no invasiva. La solución propuesta por la presente invención es determinación de la presencia del gen KIR2DS5 en el genoma del paciente.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención es un procedimiento para la predicción de cirrosis hepática alcohólica no vírica en un sujeto, que comprende la detección de la presencia del gen KIR2DS5 en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, la comparación del 10 resultado de la detección anterior con un control y la evaluación de su predisposición genética a desarrollar la enfermedad a partir de la comparación anterior. En un aspecto más restrictivo, la invención consiste en el procedimiento anterior.

La invención es capaz de predecir que KIR2DS5 es un factor de riesgo determinante 15 de la probabilidad de desarrollo de cirrosis alcohólica no vírica, producida sólo por el consumo de alcohol e independiente de la intervención de otros factores patológicos, como por ejemplo su asociación a hepatitis producidas por infecciones virales.

En un aspecto preferible del procedimiento de la invención, dicha muestra biológica es 20 una muestra de sangre. En otro aspecto preferible es una muestra de tejido, y en un aspecto preferible más es una muestra de saliva. Otro aspecto muy preferible de la invención es que dicho sujeto sea un sujeto de sexo masculino.

Funcionalmente no se conoce aún un ligando específico para KIR2DS5, pero dado el 25 efecto observado en esta patología cabe suponer que este receptor sea dependiente de la existencia de un ligando que pueda ser sobreexpresado en células hepáticas implicadas en la progresión de la fibrosis, y capaz de mediar en el papel protector de las células NK activadas frente a la fibrosis hepática. Este papel sería sólo atribuible a la acción del gen KIR2DS5 entre los genes activadores, cuya acción no se ve tampoco 30 afectada por la presencia concomitante de otros genes KIR inhibidores. Estos genes KIR inhibidores no sólo no se asocian con la predisposición a padecer la enfermedad sino que pueden incluso resultar elementos de protección frente a la misma, como es el caso de KIR2DL2.

Se ha realizado un análisis del perfil de genes KIR inhibidores y activadores de individuos sanos y de pacientes dirigido a conocer la frecuencia del gen activador KIR2DS5 en la población enferma.

En la Tabla 1 se recogen las frecuencias de genes KIR para el total de pacientes 5 varones incluidos en el estudio y para el total de individuos sanos varones usados como grupo control, así como los resultados del análisis univariable de la presencia de los genes estudiados en el genotipo de los pacientes y controles. Se observa que KIR2DS5 es el único gen KIR que resulta asociado a cirrosis alcohólica de origen no vírico de forma altamente significativa. Se comporta como un factor de alto riesgo para 10 el padecimiento de dicha enfermedad ya que indica una predisposición a padecerla en sujetos que son portadores del dicho gen. Además de la presencia de este gen y de manera independiente, la única variable que es también capaz de influir positivamente en el desarrollo de la enfermedad es la edad. Por el contrario y en contraste con KIR2DS5, la presencia del gen KIR2DL2 se asocia negativamente con la enfermedad. 15

Tabla 1. Frecuencia de genes KIR en pacientes varones con cirrosis alcohólica no viral y viral, y en controles sanos que no desarrollan la enfermedad.

Pacientes con cirrosis alcohólica

Controles Sanos N=319

Total pacientes N=281

No infección viral

N=213

Infección viral N=68

KIR genes*

P/A

n (%)

n (%)

P1

n (%)

n (%)

P2

P3

P4

iKIRs

2DL1 (S1-)

+

197 (61, 8)

160 (56, 9)

0, 244

115 (54, 0)

(66, 2)

0, 088

0, 581

0, 092

-

122 (38, 2)

121 (43, 1)

(46, 0)

(33, 8)

2DL2

+... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la predicción de cirrosis hepática alcohólica no vírica en un sujeto, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

- detección de la presencia del gen KIR2DS5 en una muestra biológica obtenida 5 de dicho sujeto,

- comparación del resultado de la detección anterior con un control, y

- evaluación de la predisposición genética de dicho sujeto a desarrollar cirrosis hepática no vírica a partir de la comparación anterior.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha muestra biológica es una muestra de sangre.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha muestra biológica es una muestra de tejido.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha muestra 15 biológica es una muestra de saliva.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicho sujeto es de sexo masculino.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicha detección comprende una reacción en cadena de polimerasa. 20

7. Oligonucleótido caracterizado por que está identificado por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y sus secuencias complementarias.

8. Un oligonucleótido según la reivindicación 7, caracterizado por que presenta una identidad de secuencia de al menos el 95% con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. 25

9. Un oligonucleótido según la reivindicación 8, caracterizado por que dicha identidad es de al menos el 91%.

10. Un oligonucleótido según la reivindicación 9, caracterizado por que dicha identidad es de al menos el 89%.

11. Un oligonucleótido según la reivindicación 10, caracterizado por que dicha 30 identidad es de al menos el 87%.

12. Uso de un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, como cebador para la secuencia del genoma humano.

13. Uso de un cebador según la reivindicación 12, o sus variables funcionales, para la detección del gen KIR2DS5 por la reacción en cadena de la polimerasa. 35

14. Kit para la realización del procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que comprende reactivos específicos para la detección del gen KIR2DS5 en una muestra biológica de un sujeto, instrucciones para el uso de dichos reactivos y un dispositivo para determinar si el resultado de dicha detección es indicativo de la predisposición genética de dicho sujeto a desarrollar cirrosis 5 hepática no vírica a partir de la comparación con un control.

15. Kit para la predicción de cirrosis hepática no vírica de un sujeto, caracterizado por que comprende al menos uno de los cebadores identificados como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, o sus secuencias complementarias o sus variables funcionales.