Polipéptidos terapéuticos, homólogos de los mismos, fragmentos de los mismos y su uso en modular la agregación mediada por plaquetas.

Una construcción de polipéptido que consiste en uno o más anticuerpos de dominio único dirigidos contra el factor de von Willebrand (vWF) y opcionalmente un conector peptídico,

en la que el anticuerpo o anticuerpos de dominio único está/n seleccionado/s del grupo de anticuerpos de dominio único que consiste en las secuencias representadas por cualquiera de SEC ID N.º: 3, 5 o 7, o una secuencia homóloga de cualquiera de SEC ID N.º: 3, 5 o 7, con una identidad de secuencias superior al 70 % con la secuencia parental; y en la que dicha secuencia homóloga puede inhibir al menos el 50 % de agregación de plaquetas a una tasa de cizallamiento de 1600 s-1 a una concentración entre 0,08 y 0,3 μg/ml.

Polipéptidos terapéuticos, homólogos de los mismos, fragmentos de los mismos y su uso en modular la agregación mediada por plaquetas

Antecedentes a la Invención

Tras el daño a un vaso sanguíneo, quedan expuestas estructuras subendoteliales que median en la adhesión de plaquetas mediante la interacción con factor de von Willebrand (vWF). El vWF forma un puente entre el colágeno dentro de la pared del vaso dañado y el receptor de plaquetas, la glicoproteína Ib (gplb), una interacción especialmente importante en condiciones de alto cizallamiento, que conducen a la formación de un tapón hemostático y que así previene la excesiva hemorragia (Bennett S, Thromb Flaemost (2001) Mar;85(3):395-400). Durante la hemostasia normal, estos procesos conducen a la cicatrización de la pared del vaso sanguíneo dañado. En afecciones patológicas, sin embargo, la excesiva función de las plaquetas puede conducir a la formación de trombos. La subunidad de vWF está compuesta por varios dominios homólogos que cubren cada uno diferentes funciones. El vWF interacciona mediante su dominio A3 con fibras de colágeno fibrilary mediante su dominio A1 con el receptor de plaquetas gplb. Bajo condiciones normales, las plaquetas y vWF no interaccionan. Sin embargo, cuando vWF se une a colágeno a alta tasa de cizallamiento, se cree que experimenta un cambio conformacional que permite su unión con el receptor de plaquetas gplb. Esta adhesión reversible permite que las plaquetas pasen por encima del área dañada, que luego va seguido de una adhesión firme mediante los receptores de colágeno sobre las plaquetas (gpla/lla, gpVI, gplV, p65, TIIICBP), produciendo la activación de las plaquetas. Esto conduce a la activación del receptor de gpllb/llla, unión a fibrinógeno, y finalmente a la agregación de plaquetas.

Se han aislado inhibidores de la agregación de plaquetas de organismos hematófagos tales como la sanguijuela. La saratina, derivada de la sanguijuela /-//rudo med/c/na//s, se describe en el documento WO 02/15919 A2 y en Cruz CP et al. ref. La saratina, un inhibidor de la adhesión de plaquetas dependiente del factor de von Willebrand, disminuye la agregación de plaquetas y la hiperplasia de la íntima en un modelo de endarterectomía de carótida de rata. Journal of Vascular Surgery, 2001, 34: 724-729 y en Smith TP et al., Saratin, an inhibitor of collagen-platelet interaction, decreases venous anastomotic intimal hyperplasia in a canine dialysis access model, Vasc Endovascular Surg. 2003 Jul-Aug;37(4):259-69.

Se han desarrollado terapéuticos basados en anticuerpos, algunos de los cuales se usan actualmente en terapia.

Abciximab (Fab 7E3 quimérico; ReoPro; documentos US 6.071.514, EP 0 882 453), el fragmento Fab del anticuerpo quimérico humano de ratón 7E3 que inhibe la unión del ligando al receptor de plaquetas gpllb/llla, fue aprobado para uso humano como terapia auxiliar para prevenir complicaciones isquémicas de intervenciones coronarias percutáneas en diciembre de 1994. La principal cuestión de seguridad con inhibidores de gp llb/llla es el riesgo de hemorragia, ya que el potente efecto antiplaquetario de estos fármacos puede afectar adversamente la hemostasia.

Se desarrolló un anticuerpo monoclonal murino contra el dominio A1 de vWF (documentos US 2002/0028204 A1; US 6.280.731 y en WO 00/10601) y contra su conformación activa (documento US 6.251.393). La eficacia /n v/vo se describe en Kageyama S, et al.: "Effect of a humanized monoclonal antibody to von Willebrand factor in a canine model of coronary arterial thrombosis", Eur J Pharmacol. 2002 May 17;443(1-3):143-9, y en "Anti-human WVF monoclonal antibody, AJvW-2 Fab, inhibits repetitive coronary artery thrombosis without bleeding time prolongaron in dogs". Thromb Res., 2001 Mar 1;101(5):395-404, y en "Anti-human von willebrand factor monoclonal antibody AJvW- 2 prevenís thrombus deposition and neointima formation after balloon injury in guinea pigs". Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000 Oct;20(10):2303-8). AJvW-2 inhibió la agregación de plaquetas humanas inducida por la alta fuerza de cizallamiento y no tuvo efecto sobre la agregación de plaquetas por la baja fuerza de cizallamiento.

Los efectos en babuinos de un anticuerpo murino 82D6A3 producido contra el dominio A3 de vWF humano se desvelan en el documento WO 02/051351, y Dongmei Wu et al., "Inhibition of the von Willebrand (VWF)-collagen interaction by an antihuman VWF monoclonal antibody results in abolition of in vivo arterial platelet thrombus formation in baboons". Hemostasis, thrombosis and vascular biology, 2002, 99: 3623-3628.

El anticuerpo 6B4 es un anticuerpo monoclonal (mAb) producido contra gplb humana purificada. El mAb 6B4 inhibe la aglutinación de plaquetas humanas dependiente de vWF inducida tanto por ristocetina como por botrocetina. Además, el mAb 6B4 bloquea la adhesión inducida por cizallamiento de plaquetas humanas a colágeno I. Cuando se inyecta en babuinos, IgG intacta y sus fragmentos F(ab')(2) provocaron trombocitopenia casi inmediata, debido a la bivalencia de F(ab')(2) que media en la reticulación de plaquetas, o interacciones de Fc:receptorde Fe que median en la activación de la agregación de plaquetas (documento WO 0110911; Cauwenberghs N. et al., Arteriesclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 2000, 20: 1347 y véase, por ejemplo, Cadroy Y et al, Blood, 1994, 83: 3218- 3224, Becker BH et al, Blood, 1989, 74: 690-694, RavanatC. et al, Thromb. Haemost. 1999, 82: 528a abstract). Se inhibió la deposición de plaquetas sobre pericardio bovino rico en colágeno cuando los fragmentos Fab se inyectaron en los babuinos antes de generarse un trombo. Sin embargo, cuando los fragmentos Fab se inyectaron después de que se dejara formar un trombo, no se observó inhibición de la posterior trombosis. Los rendimientos de expresión de dichas moléculas de Fab son muy bajos y el método de producción es muy laborioso.

Objetivos de ia presente invención

Es un objetivo de la presente invención proporcionar polipéptidos que comprendan uno o más anticuerpos de dominio único dirigidos hacia vWF, dominio A1 de vWF, dominio A1 de vWF activado, dominio A3 de vWF, gplb y/o colágeno, homólogos de dichos polipéptidos y/o porciones funcionales de dichos polipéptidos, para el tratamiento para condiciones que requieren una modulación de la agregación mediada por plaquetas y que vence los problemas del estado de la técnica. Es otro objetivo proporcionar métodos de producción de dichos polipéptidos, métodos de recubrimiento de dispositivos con tales polipéptidos usados en procedimientos médicos (por ejemplo, PCTA, implantación de endoprótesis vascular), métodos y kits para cribar agentes que modulan la agregación mediada por plaquetas y kits para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la agregación mediada por plaquetas.

Sumario de ia invención

Se han preparado anticuerpos de dominio único que reconocen específicamente moléculas diana que participan en la primera etapa y etapas posteriores de la agregación de plaquetas. Esto hace que los agentes antitrombóticos sean más eficaces y más seguros.

Una realización de la presente invención es una construcción de polipéptido según la reivindicación 1.

Otra realización descrita en el presente documento es una construcción de polipéptido como se ha descrito anteriormente, en la que el anticuerpo de dominio único dirigido contra el dominio A1 de vWF activado reconoce específicamente la conformación de vWF activado en el sitio de formación del trombo, pero no se une a formas ¡nactivadas circulantes de vWF.

Otra realización descrita en el presente documento es una construcción de polipéptido como se ha descrito anteriormente, que comprende además al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra una o más proteínas del suero.

Otra realización descrita en el presente documento es una construcción de polipéptido como se ha descrito anteriormente, en la que dicha al menos una proteína del suero es cualquiera de seroalbúmina, inmunoglobulinas del suero, proteína de unión a tiroxina, transferrina, o fibrinógeno o un fragmento de las mismas.

Otra realización descrita en el presente documento es una construcción de polipéptido como se ha descrito anteriormente, en la que al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra uno o más proteínas del suero se corresponde con una secuencia representada por cualquiera de SEC ID N.°: 16 a 19 y 49 a 61.

Otra realización descrita en el presente documento es una construcción de polipéptido como se ha descrito anteriormente correspondiente a una secuencia representada por cualquiera de SEC ID N.°: 13 a 15 y 42 a 45.

Otra realización descrita en el presente documento es una... [Seguir leyendo]

1.- Una construcción de polipéptido que consiste en uno o más anticuerpos de dominio único dirigidos contra el factor de von Willebrand (vWF) y opcionalmente un conector peptídico, en la que el anticuerpo o anticuerpos de dominio único está/n seleccionado/s del grupo de anticuerpos de dominio único que consiste en las secuencias representadas por cualquiera de SEC ID N.°: 3, 5 o 7, o una secuencia homologa de cualquiera de SEC ID N.°: 3, 5 o 7, con una Identidad de secuencias superior al 70 % con la secuencia parental; y en la que dicha secuencia homologa puede Inhibir al menos el 50 % de agregación de plaquetas a una tasa de cizallamiento de 1600 s*^ a una concentración entre 0,08 y 0,3 pg/ml.

2.- La construcción de polipéptido según la reivindicación 1, en la que al menos un anticuerpo de dominio único se corresponde con una secuencia representada por SEC ID N.°: 3, o con una secuencia homologa de SEC ID N.°: 3 con una Identidad de secuencias superior al 70 % con la secuencia parental.

3.- La construcción de polipéptido según la reivindicación 1, en la que al menos un anticuerpo de dominio único se corresponde con una secuencia representada por SEC ID N.°: 5, o con una secuencia homologa de SEC ID N.°: 5 con una Identidad de secuencias superior al 70 % con la secuencia parental.

4.- La construcción de polipéptido según la reivindicación 1, en la que al menos un anticuerpo de dominio único se corresponde con una secuencia representada por SEC ID N.°: 7, o con una secuencia homologa de SEC ID N.°: 7 con una Identidad de secuencias superior al 70 % con la secuencia parental.

5 - La construcción de polipéptido según la reivindicación 1, en la que la construcción de polipéptido consiste en dos anticuerpos de dominio único dirigidos contra el factor de von Willebrand; y

i. en la que al menos un anticuerpo de dominio único se corresponde con una secuencia representada por SEC ID N.°: 3 o con una secuencia homologa de SEC ID N.°: 3 con una identidad de secuencias superior al 70%, o

¡i. en la que al menos un anticuerpo de dominio único se corresponde con una secuencia representada por SEC ID N.°: 5, o con una secuencia homologa de SEC ID N.°: 5 con una identidad de secuencias superior al 70%, o

i¡¡. en la que al menos un anticuerpo de dominio único se corresponde con una secuencia representada por SEC ID N.°: 7, o con una secuencia homologa de SEC ID N.°: 7 con una identidad de secuencias superior al

70 %.

6 - Construcción de polipéptido, que comprende la construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra la seroalbúmina, en la que el al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra la seroalbúmina se corresponde con una secuencia representada por cualquiera de SEC ID N.°: 16 a 19 o con una secuencia homologa de cualquiera de SEC ID N.°: 16 a 19 con una identidad de secuencias superior al 70 % con la secuencia parental.

7 - La construcción de polipéptido según la reivindicación 6 correspondiente a una secuencia representada por cualquiera de SEC ID: 13 a 15.

8 - La construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7, en la que al menos un anticuerpo de dominio único es un dominio VHH.

9 - La construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 8, en la que al menos un anticuerpo de dominio único es un dominio VHH que se obtiene inmunizando un camello y obteniendo hibridoma del mismo, o clonando una biblioteca de anticuerpos de dominio único y posteriormente seleccionando el VHH usando expresión en fago.

10 - La construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 9, en la que al menos un anticuerpo de dominio único está humanizado

11- La construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 10, en la que al menos un anticuerpo de dominio único es un dominio VHH humanizado.

12 - La construcción de polipéptido según la reivindicación 11, en la que al menos un anticuerpo de dominio único se humaniza reemplazando uno o más de los aminoácidos de Came//dae con sus homólogos humanos como se encuentra en una secuencia consenso humana.

13 - La construcción de polipéptido según las reivindicaciones 11 o 12, en la que al menos un anticuerpo de dominio único se humaniza reemplazando cualquiera de los siguientes residuos tanto solos como en combinación: posiciones FR1 1, 5, 28 y 30, los aminoácidos distintivos en las posiciones FR2 37, 44, 45 y 47, posiciones FR3 74, 75, 76, 83, 84, 93 y 94 y 4 103, 104, 108 y 111, en la que la numeración de las posiciones es según la numeración de Kabat.

14 - La construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 13, en la que el conector peptídico opcional consiste en tres residuos de alanina.

15 - La construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 13, en la que el extremo C del primer anticuerpo de dominio único está ligado al extremo N del siguiente anticuerpo de dominio único.

16 - La construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha secuencia homologa no puede inhibir el 50 % de agregación de plaquetas a una tasa de cizallamiento de 300 s*^ a 10 pg/ml o a concentraciones menores.

17 - Una composición que comprende una construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18 - La composición que comprende una construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 16 adaptada a la vía de administración elegida, en la que la vía de administración es oral o parenteral, intranasal por inhalación, intravenosa, intramuscular, tópica o subcutánea; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19 - Una composición que comprende una construcción de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y al menos un agente trombolítico, para administración simultánea, separada o secuencial a un sujeto.

20 - La composición según la reivindicación 19, en la que dicho agente trombolítico es cualquiera de estafilocinasa, activador tisular del plasminógeno, estreptocinasa, estreptocinasa monocatenaria, urocinasa y complejo adiado de plasminógeno-estreptocinasa.

21- Un ácido nucleico que codifica una construcción de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

22 - Una construcción de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de trastornos relacionados con la agregación mediada por plaquetas o disfunción de la misma.

23 - La construcción de polipéptido según la reivindicación 22, en la que dichos trastornos son cualquiera que surja de angina inestable, angina estable, angina de pecho, formación de émbolos, trombosis venosa profunda, síndrome urémico hemolítico, anemia hemolítica, insuficiencia renal aguda, complicaciones trombolíticas, púrpura trombocitopénica trombótica, coagulopatía intravascular diseminada, trombosis, cardiopatía coronaria, complicaciones tromboembólicas, infarto de miocardio, reestenosis y formación de trombosis auricular en fibrilación auricular, angina inestable crónica, ataques isquémicos transitorios y accidentes cerebrovasculares, enfermedad vascular periférica, trombosis arterial, preeclampsia, embolia, reestenosis y/o trombosis tras angioplastia, endarterectomía carotídea, anastomosis de injertos vasculares y exposición crónica a dispositivos cardiovasculares.

24 - La construcción de polipéptido según la reivindicación 22, en la que dichos trastornos son cualquiera que surja de ataque isquémico cerebral transitorio, angina inestable o estable, angina de pecho, infarto cerebral, infarto de miocardio, enfermedad oclusiva arterial periférica, reestenosis, injerto de derivación coronaria, o valvuloplastia de la arteria coronaria e intervenciones coronarias tales como angioplastia, implantación de endoprótesis vascular, endarterectomía carotídea o aterectomía.

25 - La construcción de polipéptido según la reivindicación 22, en la que dichos trastornos son cualquiera de formación de un trombo no oclusivo, formación de un trombo oclusivo, formación de trombo arterial, oclusión coronaria aguda, reestenosis, reestenosis después de PCTA o implantación de endoprótesis vascular, formación de trombo en arterias estenosadas, hiperplasia después de angioplastia, aterectomía o implantación de endoprótesis arterial, síndrome oclusivo en un sistema vascular o falta de permeabilidad de las arterias enfermas.

26 - La construcción de polipéptido según la reivindicación 22, en la que dichos trastornos son trastornos que se producen por la formación de placas o de trombos en entornos de alto cizallamiento.

27 - Un método de producción de una construcción de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende

(a) cultivar células huésped que comprenden ácido nucleico que puede codificar un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, y,

(b) recuperar el polipéptido producido del cultivo.

28 - Un método según la reivindicación 27, en el que dichas células huésped son bacterianas o levadura.

29 - Un método para tratar dispositivos médicos invasivos para prevenir la agregación mediada por plaquetas alrededor del sitio de invasión que comprende la etapa de recubrir dicho dispositivo con una construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 16.

30.- Un método de diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por disfunción de la agregación mediada por plaquetas que comprende las etapas de:

5 (a) poner en contacto una muestra con una construcción de polipéptido según las reivindicaciones 1 a 16, y

(b) detectar la unión de dicha construcción de polipéptido a dicha muestra, y

(c) comparar la unión detectada en la etapa (b) con un patrón, en la que una diferencia en la unión con respecto a dicha muestra es diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por disfunción de la agregación mediada por plaquetas.