Polinucleótidos que codifican nuevas variantes de PCSK9.

Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:

(a) un polinucleótido que codifica la secuencia aminoacídica expuesta en SEC ID Nº: 2;

(b) la secuencia de ADNc de PCSK9-b incluida en el Nº de depósito de la ATCC®: PTA-7622, que codifica la secuencia aminoacídica expuesta en SEC ID Nº: 2;

(c) un polinucleótido que codifica la secuencia aminoacídica expuesta en SEC ID Nº: 4;

(d) la secuencia de ADNc de PCSK9-c incluida en el Nº de depósito de la ATCC®: PTA-7622, que codifica la secuencia aminoacídica expuesta en SEC ID Nº: 4; y

(e) la secuencia complementaria completa de (a), (b), (c) o (d).

Polinucleótidos que codifican nuevas vanantes de PCSK9 Campo de ¡a invención

La presente invención proporciona nuevos polinucleótidos que codifican polipéptidos de PCSK9b y PCSK9c, fragmentos y homólogos de los mismos. También se proporcionan vectores, células hospedadoras, anticuerpos, y métodos recombinantes y sintéticos para producir dichos polipéptidos. La invención también se refiere al uso diagnóstico y terapéutico de estos nuevos polipéptidos de PCSKÓb y PCSK9c en el diagnóstico, tratamiento, y/o prevención de vahas enfermedades y/o trastornos relacionados con estos polipéptidos.

Antecedentes de la invención

La aterosclerosis es una enfermedad de las arterias responsable de la insuficiencia cardíaca coronaria (ICC), subyacente a la mayoría de las muertes en países industrializados (Lusis, 2000). Actualmente se han determinado varios factores de riesgo para la ICC: dislipidemias, hipertensión, diabetes, tabaquismo, mala alimentación, inactividad y estrés. Las dislipidemias más relevantes y comunes clínicamente están caracterizadas por un aumento en las beta-lipoproteínas (partículas de VLDL y LDL) con hipercolesterolemia en ausencia o presencia de hipertrigliceridemia (Fredhckson et al., 1967). Un alivio aislado del colesterol de LDL es uno de los factores de riesgo más comunes para la CU. Los estudios en gemelos (Austin et al., 1987) y los datos familiares (Perusse, 1989; Rice et al., 1991) han demostrado la importancia de los factores genéticos en el desarrollo de la enfermedad, particularmente cuando sus complicaciones aparecen a una edad temprana. Se han identificado formas mendelianas de hipercolesterolemia: primeramente la forma dominante autosómica (ADH) (Khachadurian, 1964) y posteriormente la forma recesiva autosómica (ARH), inicialmente descrita como "hiperlipoproteinemia de tipo II seudohomocigótica" (Morganroth et al., 1967).

La ADH es un trastorno genético heterogéneo. Su forma más frecuente y arquetípica es la hipercolesterolemia familiar (HF) con una frecuencia de 1 por cada 500 para los heterocigotos y 1 por millón para homocigotos (Goldstein et al., 1973). La enfermedad es codominante, viéndose afectados los homocigotos antes y de manera más grave que los homocigotos. La HF está causada por mutaciones en el gen que codifica el receptor de LDL (Goldstein y Brown, 1978) (LDLR en 19p13.1 -p13.3) (MIN 143890). Esta está caracterizada por un aumento selectivo en los niveles de colesterol de LDL en plasma, dando lugar a xantomas de tendones y piel, arco corneano y depósitos cardiovasculares que dan lugar a aterosclerosis progresiva y prematura, ICC y mortalidad (sucediendo antes de los 55 años). La segunda forma de ADN es la apo B-100 familiar defectuosa (FDB) causada por mutaciones en el gen de apolipoproteína B (APOB e 2p23-p24), que codifica el ligando del receptor de LDL (Inneraty et al., 1987) (MIN 144010). Se ha comunicado la existencia de un mayor nivel de heterogeneidad genética en la ADH (Sain-Jore et al., 2000) y se ha detectado y mapeado la Implicación de un tercer locus denominado HCHOLA3 (anteriormente FH3) en 1 p34.1 -p32 en una familia francesa (Varret et al., 1999) (MIM 603776). Estos resultados se confirmaron por Hunt et al. en un clan de Utah (Hunt et al., 2000).

PCSK9, para proproteína convertasa subtlllslna/kexlna de tipo 9 (también citada como HCHOLA3, NARC-1, o FH3) es una proteasa que pertenece a la subfamilia de protelnasa K de la familia secretora de subtilasa (Naureckiene et al., Arch. of Blochem. And Blophy., 420:55-57 (2003)). Se ha demostrado que PCSK9 tiene un papel en la homeostasis del colesterol regulando la secreción del receptor de apolipoproteína. También puede tener un papel en la diferenciación de neuronas corticales cerebrales (Seldah et al., PNAS 100(3):928-933 (2003)).

El gen de PCSK9 de tipo silvestre contiene 12 exones. La proteina traducida contiene un péptldo de señal en el extremo NH2, y en células y tejidos se encuentra una forma (precursora) de zimògeno de aproximadamente 74 kDa de la proteina de longitud completa en el retículo endoplásmico. Durante el procesamiento Inicial en la célula, el péptido de prodomlnlo de aproximadamente 14 kDa se escinde autocatalítlcamente para producir una proteina madura de aproximadamente 60 kDa que contiene el dominio catalítico y un dominio C-termlnal, a menudo citado como dominio rico en histidina (CHRD) (Figura 1). Esta forma de aproximadamente 60 kDa de PCSK9 se secreta por células hepáticas. La forma secretada de PCSK9 parece ser la especie fisiológicamente Activa, aunque no se ha descartado un papel funcional ¡ntracelular de la forma de aproximadamente 60 kDa.

Se conocen varias formas mutantes de PCSK9, Incluyendo S127R, N157K, F216L, R218S, y D374Y, estando S127R, F216L, y D374Y relacionadas con la hipercolesterolemia dominante autosómica (ADH). Benjannet et al. (J. Blol. Chem., 279(47):48865-48875 (2004)) demostraron que las mutaciones S127R y D374Y dan como resultado una disminución significativa en el nivel de pro-PCSK9 procesada en el RE para formarei zimògeno activo secretado. Por consiguiente, se cree que PCSK9 aumenta la velocidad de renovación del receptor de LDL causando la Inhibición de la eliminación de LDL (Maxwell et al., PNAS, 102(6):2069-2074 (2005); Benjannet et al., y Lalanne et al); mientras que las mutaciones dominantes autosómlcas de PCSK9 dan como resultado niveles aumentados de LDLR, eliminación aumentada de LDL circulante, y una disminución correspondiente en los niveles de colesterol en plasma (Rashld et al., PNAS, 102(15):5374-5379 (2005).

Lalanne et al. demostraron que el catabolismo de LDL estaba alterado y la síntesis de lipoproteínas que contienen apolipoproteína B estaba potenciada en dos pacientes portadores de mutaciones S127R en PCSK9 (J. Lipid Research, 46:1312-1319 (2005)). Sun et al. también proporcionaron pruebas de que las formas mutantes de PCSK9 también son la causa de una hipercolesterolemia dominante inusualmente grave como consecuencia de su efecto aumentador de la secreción de apolipoproteína B (Sun et al., Hum. Mol. Genet., 14(9):1161-1169 (2005)). Estos resultados fueron coherentes con resultados anteriores que demostraron que la sobreexpresión mediada por adenovirus de PCSK9 en ratones da como resultado hipercolesterolemia grave debido a disminuciones drásticas en la cantidad de receptor de LDL; Dubuc et al., Thromb. Vasc. Biol., 24:1454-1459 (2004), además de con resultados que demuestran que las formas mutantes de PCSK9 también reducen el nivel de receptor de LDL (Park et al., J. Biol. Chem., 279:50630-50638 (2004). La sobreexpresión de PCSK9 en líneas celulares, incluyendo células derivadas del hígado, y en hígados de ratones ;n v/vo, da como resultado una disminución pronunciada en los niveles de proteína LDLR y en actividad funcional de LDLR sin cambios a nivel de ARNm de LDLR (Maxwell K. N., Breslow J. L., Proc. Nat. Amer. Sci., 101:7100-7105 (2004). Benjannet S. et al., J. Bio. Chem. 279: 48865-48875 (2004)).

Usando los ejemplos anteriores, queda claro que la disponibilidad de nuevas formas de PCSK9 proporciona una oportunidad para la identificación de agonistas de PCSK9, así como para la identificación de inhibidores de PCSK9. Todos los cuales podrían ser terapéuticamente útiles en diferentes circunstancias.

La presente invención también se refiere a vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención, y a células hospedadoras que contienen los vectores recombinantes, así como a métodos para producir dichos vectores y células hospedadoras, además de su uso en la producción de polipéptidos o péptidos de PCSK9b y PCSK9c usando técnicas recombinantes. Se proporcionan métodos sintéticos para producir los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención. También se proporcionan métodos diagnósticos para detectar enfermedades, trastornos, y/o afecciones relacionadas con los polipéptidos y polinucleótidos de PCSK9b y PCSK9c, y usos de los polipéptidos en métodos terapéuticos para tratar dichas enfermedades, trastornos, y/o afecciones.

Breve sumario de ia invención

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aislado que comprenden, o como alternativa consisten en, un polinucleótido que codifica la proteína PCSK9b que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 1A-C (SEC ID N-: 2), respectivamente, o la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc, PCSK9b (también citado como PCSK9-b), depositado como Número de Depósito de la ATCC@ PTA-7622 el 10 de mayo de 2006.

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aislado que comprenden, o como alternativa consisten en, un polinucleótido que codifica la proteína PCSK9c... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:

(a) un polinucleótido que codifica la secuencia aminoacídica expuesta en SEC ID N-: 2;

(b) la secuencia de ADNc de PCSK9-b incluida en el N- de depósito de la ATCC@: PTA-7622, que codifica la secuencia aminoacídica expuesta en SEC ID N-: 2;

(c) un polinucleótido que codifica la secuencia aminoacídica expuesta en SEC ID N-: 4;

(d) la secuencia de ADNc de PCSK9-C incluida en el N- de depósito de la ATCC@: PTA-7622, que codifica la secuencia aminoacídica expuesta en SEC ID N-: 4; y

(e) la secuencia complementaria completa de (a), (b), (c) o (d).

2. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.

3. Una célula hospedadora recombinante aislada que comprende las secuencias de vector de la reivindicación 2.

4. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica expuesta en SEC ID N-: 2; y

(b) un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica expuesta en SEC ID N-: 4.

5. Un anticuerpo aislado que se une específicamente al polipéptido aislado de SEC ID N-: 2 o SEC ID N-: 4.

6. Una célula hospedadora recombinante que expresa el polipéptido aislado de la reivindicación 4.

7. Un método para producir un polipéptido aislado, que comprende:

(a) cultivar la célula hospedadora recombinante de la reivindicación 6 en condiciones tales que dicho polipéptido se exprese; y

(b) recuperar dicho polipéptido.

8. El polipéptido de la reivindicación 4 para su uso en prevenir, tratar o mejorar una afección médica.

9. Un método para diagnosticar una afección patológica o una susceptibilidad a una afección patológica en un sujeto, que comprende:

(a) determinar en una muestra biológica del sujeto la presencia o la ausencia de una mutación en el polinucleótido de la reivindicación 1 ; y

(b) diagnosticar una afección patológica o una susceptibilidad a una afección patológica basándose en la presencia o la ausencia de dicha mutación.

10. Un método para diagnosticar una afección patológica o una susceptibilidad a una afección patológica en un sujeto, que comprende:

(a) determinar en una muestra biológica del sujeto la presencia o el grado de expresión del polipéptido de la reivindicación 4 en una muestra; y

(b) diagnosticar una afección patológica o una susceptibilidad a una afección patológica basándose en la presencia o el grado de expresión del polipéptido.

11. El polipéptido de la reivindicación 4 para el uso de la reivindicación 8 en donde la afección médica se selecciona del grupo que consiste en: trastorno cardiovascular; hipercolesterolemia; hipercolesterolemia dominante autosómica; trastornos asociados con la función aberrante del receptor de LDL; trastornos asociados con apolipoproteína B; trastornos asociados con la hipercolesterolemia recesiva autosómica; trastornos asociados con el colesterol elevado; trastornos asociados con LDL elevadas; trastornos asociados con la velocidad de eliminación reducida de las LDL en el hígado; trastornos asociados con la producción elevada de apoB de LDL; hipercolesterolemia familiar; trastornos del metabolismo de lípidos; LDL elevadas; depósitos de colesterol; xantomas de tendón; ateroma; arteriosclerosis prematura; enfermedad coronaria; apolipoproteína B defectuosa familiar; hipersensibilidad a estatinas; trastornos asociados con la degradación acelerada de LDLR; trastornos de la diferenciación neural; un trastorno metabòlico; un trastorno metabòlico seleccionado del grupo que consiste en: dislipidemia; dislipidemia diabética; dislipidemia mixta; hipercolesterolemia; hipertrigliceridemia; diabetes mellitus de tipo II; diabetes de tipo I; resistencia a la insulina; hiperlipidemia; obesidad; y anorexia nerviosa.

12. El método de las reivindicaciones 9 o 10 en donde la afección patológica se selecciona del grupo que consiste en: trastorno cardiovascular; hipercolesterolemia; hipercolesterolemia dominante autosómica; trastornos asociados con la función aberrante del receptor de LDL; trastornos asociados con apolipoproteína B; trastornos asociados con la

hipercolesterolemia recesiva autosómica; trastornos asociados con el colesterol elevado; trastornos asociados con LDL elevadas; trastornos asociados con la velocidad de eliminación reducida de las LDL en el hígado; trastornos asociados con la producción elevada de apoB de LDL; hipercolesterolemia familiar; trastornos del metabolismo de lípidos; LDL elevadas; depósitos de colesterol; xantomas de tendón; ateroma; arteriesclerosis prematura; enfermedad 5 coronarla; apollpoproteína B defectuosa familiar; hlpersenslbllldad a estatlnas; trastornos asociados con la degradación acelerada de LDLR; trastornos de la diferenciación neural; un trastorno metabóllco; un trastorno metabóllco seleccionado del grupo que consiste en: dlsllpldemla; dlsllpldemla diabética; dlsllpidemla mixta; hipercolesterolemia; hlpertrlgllcerldemla; diabetes mellltus de tipo II; diabetes de tipo I; resistencia a la Insulina; hlperllpidemla; obesidad; y anorexia nerviosa.