PÉPTIDO Y COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER.

Péptido y composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

La presente invención se relaciona con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, con la condición de que dicho péptido no tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, y el uso del mismo para el tratamiento de enfermedades que cursen con proliferación celular, en particular, para el tratamiento del cáncer y la metástasis. Asimismo, también se incluyen dentro de la presente invención la composición farmacéutica y el kit que comprende dicho péptido.

La presente invención se relaciona con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, con la condición de que dicho péptido no tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, y el uso del mismo para el tratamiento de enfermedades que cursen con proliferación celular, en particular, para el tratamiento del cáncer y la metástasis. Por lo tanto, la presente invención se incluye dentro del campo de la medicina, en particular, en el campo del tratamiento del cáncer.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Los gliomas son los tumores cerebrales más frecuentes y en general presentan muy mal pronóstico. De hecho, los pacientes diagnosticados con un glioblastoma multiforme, el tipo de glioma más frecuente y severo, presentan una esperanza de vida media que no supera el año. A pesar de los avances en el estudio de esta patología y de su tratamiento, este dato apenas ha variado en los últimos años. El alto grado de infiltración de estos tumores hace muy difícil su eliminación completa en la cirugía y por tanto la recurrencia es muy frecuente. Recientemente, se ha identificado una subpoblación en los gliomas con características semejantes a células madre, denominada “células madre de glioma” (glioma stem cells, GSC) o “células iniciadoras de glioma” (glioma initiating cells, GIC) . Estas células se caracterizan por su capacidad de auto-renovación y diferenciación en diferentes tipos celulares, su alto potencial oncogénico y su resistencia a los tratamientos convencionales. Por ello, se propone que las células madre de glioma son responsables de la recurrencia de los gliomas. Debido a la resistencia a los tratamientos convencionales, las células madre tumorales persisten tras la terapia y dada su alta capacidad oncogénica provocan la recurrencia del tumor. Por esta razón, las células madre de glioma se han convertido en una prometedora diana terapéutica, ya que su eliminación o la reversión del fenotipo de célula madre supondría que todas las células del glioma serían susceptibles a los tratamientos antitumorales. Entre las características del fenotipo de célula madre de glioma está la expresión del regulador transcripcional Id1 (Soroceanu et al. Cancer Res. 2013, 73: 1559; Gautschi et al. 2008 Cancer Res, 68: 2250-2258) , que mantiene

a la célula en un estado indiferenciado o la expresión del factor de transcripción Sox-2 (Gangemi et al. 2009. Stem cells, 27:40-48) .

La conexina43 (Cx43) [NCBI, número acceso AAA52131, versión AAA52131.1

GI:181209], la conexina más abundante en los mamíferos, es una proteína integral de membrana que se expresa ampliamente en diferentes tejidos. En el sistema nervioso central (SNC) , la Cx43 se localiza fundamentalmente en los astrocitos, la glía mayoritaria, donde forma las “gap junctions” (Gjs) , canales de comunicación intercelular que permiten el comportamiento de los astrocitos como de forma cooperativa. Desde que en los años 60 Lowenstein propusiera que las Gjs regulaban la proliferación celular, el papel de las Gjs y las conexinas en la regulación de la proliferación celular ha sido ampliamente estudiado.

En los astrocitos, la inhibición en la expresión de la Cx43, bien por péptidos endógenos como la endotelina-1 o por siRNAs específicos, aumenta la tasa de proliferación así como la captación de glucosa destinada a este proceso (Herrero-Gonzalez, et al. 2009. Glia, 57: 222-233) . Por otra parte, en un gran número de tumores, incluidos los gliomas, se observa una disminución en la expresión de la Cx43. De hecho, la expresión de la Cx43 disminuye a medida que aumenta el grado de malignidad de estos tumores (Huang et al. 1999. J Surg Oncol, 70: 21-23; Pu et al. 2004. Clin Neurol Neurosurg, 107: 49-54; Shinoura et al. 1996. J Neurosurg, 84: 839845; Soroceanu et al. 2001. Glia, 33: 107-117) . Además, la restauración de la expresión de la Cx43 en las células de glioma, bien por la transfección del cDNA o por agentes como la tolbutamida, reduce la exacerbada tasa de proliferación, indicando que la Cx43 se comporta como una proteína supresora del fenotipo tumoral en gliomas (Huang et al. 1998. Cancer Res, 58: 5089-5096; Zhu et al. 1991 citado ad supra) . Recientemente se ha descrito que las células madre de glioma apenas expresan Cx43 y que su restauración en estas células revierte el fenotipo de células madre y reduce la capacidad de estas células de generar gliomas (Yu et al. 2012. Stem Cells, 30: 108

120) .

El mecanismo por el cual la Cx43 reduce la proliferación de células de glioma no se conoce del todo. No obstante, existen estudios que muestran que la Cx43 impide el paso de G1 a la fase S del ciclo celular en las células de glioma C6 (Herrero-Gonzalez 35 et al. 2010. Oncogen, 29: 5712-5723) . Así, la Cx43 modifica la expresión de varios

genes implicados en la regulación del ciclo celular, como p21 y p27, dos inhibidores de kinasas dependientes de ciclina (CKI) . En cuanto a la vía de señalización por la que la Cx43 logra modificar la expresión de estos genes reguladores del ciclo celular, hay que mencionar que el extremo carboxilo terminal citoplasmático de la Cx43 interacciona con un gran número de señales y proteínas de andamiaje. Existen estudios que indican que la interacción con la tirosina quinasa c-Src desencadena el efecto antiproliferativo (Herrero-González et al. 2010, citado ad supra) . Cuando c-Src está activa fosforila los residuos Tyr247 y Tyr265 de la Cx43 provocando una inhibición de la comunicación intercelular. Pues bien, esta interacción entre la Cx43 y c-Src disminuye la alta actividad oncogénica de c-Src en las células de glioma de rata C6. Tanto es así que el mutante de Cx43 en Tyr247 y Tyr265, los residuos que fosforila c-Src, carece de actividad sobre la proliferación y sobre la expresión de estos reguladores del ciclo celular. En resumen, la Cx43 reduce la actividad oncogénica de c-Src y por tanto la proliferación de las células de glioma de rata C6 (Herrero-González et al. 2010, citado ad supra) .

La solicitud de patente CN101966332 describe el uso de proteínas “gap junction”, en particular Cx43, para revertir el fenotipo maligno de una célula madre cancerígena. La solicitud de patente CA2321976 describe el uso de un vector retroviral para liberar en las células una proteína “gap junction”, tal como Cx43, restaurando la expresión de dichas proteínas “gap junction” y tratando así enfermedades como el cáncer. Sin embargo, el empleo de la proteína Cx43 en clínica presenta los inconvenientes de que su solubilización en agua a concentraciones eficaces es baja así como su internalización y correcto plegamiento en la célula, lo que hace necesario el empleo de vectores y terapia génica para su administración a un individuo.

Por otro lado, la solicitud de patente WO2007/084895 describe el empleo del extremo carboxilo terminal de Cx43 en la búsqueda de compuestos ó péptidos capaces de regular la actividad de Cx43 y su empleo en el tratamiento de arritmias y cáncer. Sin embargo, la búsqueda de dichos compuestos o péptidos es un proceso lento, en el que los péptidos de interés no siempre se acaban obteniendo, y en caso de obtenerse, es necesario comprobar a posteriori su efecto, lo que puede retrasar el tratamiento eficaz de tumores o cáncer.

En vista a lo expuesto en los párrafos anteriores, existe en el estado de la técnica la necesidad de proporcionar nuevos compuestos alternativos a los descritos en el estado de la técnica, que presenten los mismos efectos que la proteína Cx43 en la reversión del fenotipo de células madre tumorales y/o la inhibición de la proliferación celular, cuya eficacia en el tratamiento de tumores ya haya sido probada, pero que su administración no presente los inconvenientes mencionados en párrafos anteriores.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Es conocido en el estado de la técnica que la conexina-43 (Cx43) revierte el fenotipo de las células madre de glioma humano, pero hasta ahora se desconocía qué parte de la proteína es responsable de dicho efecto. Los inventores han descubierto que dicho efecto reside en el extremo carboxilo terminal la Cx43, concretamente, en la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) , y que péptidos que comprendan dicha secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 presentan el mismo efecto que la Cx43, siendo útiles en el tratamiento de tumores o cáncer.

Para averiguar que dicho efecto residía en la secuencia SEQ ID NO: 1, los inventores transfectaron por electroporación células madre de glioma humano con un vector 20 conteniendo Cx43, y observaron que restaurando la expresión de Cx43 en dichas células se inhibía la actividad de c-Src, se revertía el fenotipo de célula... [Seguir leyendo]

1. Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, con la condición de que dicho péptido no tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

2.

2. Péptido según la reivindicación 1, en el que el péptido tiene una longitud de entre 18 y 100 aminoácidos.

3. Péptido según la reivindicación 1 ó 2, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.

4. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido se encuentra covalentemente unido a una secuencia de aminoácidos de 15 internalización celular.

5. Péptido según la reivindicación 4, en el que la secuencia de aminoácidos de internalización celular se encuentra unido al extremo amino terminal del péptido.

6. Péptido según la reivindicación 4 ó 5, en el que la secuencia de internalización celular comprende la SEQ ID NO: 4.

7. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el péptido comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 6.

8. Un polinucleótido que codifica un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una construcción génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación

8.

10. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 9.

11. Vector según la reivindicación 10, en el que el vector es un vector viral, en particular, un retrovirus, un lentivirus o un adenovirus.

12. Una célula que comprende un polinucleótido según la reivindicación 8, una construcción génica según la reivindicación 9 o un vector según la reivindicación 10 u 11.

13. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, una construcción génica según la reivindicación 9, un vector según la reivindicación 10 u 11, o una célula según la reivindicación 12, en elaboración de una composición farmacéutica.

14. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, una construcción génica según la reivindicación 9, un vector según la reivindicación 10 u 11, o una célula según la reivindicación 12, en elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores benignos o malignos.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que el tumor maligno es cáncer.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que el cáncer es metastásico.

17. Uso según la reivindicación 15 ó 16, en el que el tumor es un tumor cerebral.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que el tumor es un glioma.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que el glioma es un glioma seleccionado del grupo que consiste en un astrocitoma, un oligodendroglioma y un ependimoma.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que astrocitoma es un glioblastoma multiforme.

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en el que el tumor comprende células madre, en particular, células madre tumorales.

22. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, una construcción génica según la reivindicación 9, un vector según la reivindicación 10 u 11, o una célula según la reivindicación 12, en elaboración de una composición farmacéutica para prevenir

la proliferación celular y/o prevenir la metástasis del cáncer.

23. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, una construcción génica según la reivindicación 9, un vector según la reivindicación 10 u 11, o una célula según la reivindicación 12, como reactivo para inhibir in vitro de la proliferación celular y/o revertir el fenotipo de las células madre tumorales.

24. Uso según la reivindicación 22 o 23, en el que la prevención o la inhibición de la proliferación celular comprende la prevención o la inhibición de la proliferación celular de células madre, en particular, células madre tumorales, más en particular, células madre de glioma.

25. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, una construcción génica según la reivindicación 9, un vector según la reivindicación 10 u 11, o una célula según la reivindicación 12, como reactivo para inhibir in vitro la actividad de la proteína quinasa c-Scr o la actividad del regulador transcripcional Id1.

26. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, una construcción génica según la reivindicación 9, un vector según la reivindicación 10 u 11, o una célula según la reivindicación 12, para la identificación in vitro de compuestos reguladores o moduladores de la tumorigenicidad.

27. Composición farmacéutica que comprende péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, una construcción génica según la reivindicación 9, un vector según la reivindicación 10 u 11, o una célula según la reivindicación 12, en una cantidad terapéuticamente efectiva, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 37

28. Composición farmacéutica según la reivindicación 27 que comprende, además, un agente quimioterapéutico.

29. Composición farmacéutica según la reivindicación 27 ó 28, en el que dicha

composición está formulada para su administración oral, parenteral, nasal o sublingual.

30. Kit que comprende péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, una construcción génica según la reivindicación 9, un vector según la reivindicación 10 u 11, o una célula según la reivindicación 12.

31. Uso del kit según la reivindicación 30, para la determinación del efecto de dicho péptido sintético en la tumorigenicidad de una línea celular, para inhibir in vitro de la proliferación celular y/o revertir el fenotipo de las células madre tumorales o para inhibir in vitro la actividad de la proteína quinasa c-Scr o la actividad del regulador transcripcional Id1.

32. Uso según la reivindicación 31, en el que la inhibición de la proliferación celular

comprende inhibición de la proliferación celular de células madre tumorales, en particular, células madre de glioma.

DIBUJOS

FIG. 1

FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 4

FIG. 5

FIG. 5

b)

a)

FIG. 6

FIG. 7

FIG. 8

FIG. 9

FIG. 10

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad de Salamanca <120> Péptido y composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer

<130> ES1367.65

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido <400> 1

Ala Tyr Phe Asn Gly Cys Ser Ser Pro Thr Ala Pro Leu Ser Pro Met 1 5 10 15

Ser Pro <210> 2

<211> 127

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos del extremo carboxilo terminal de la proteína Conexina43

<400> 2

Ser Pro Ser Lys Asp Cys Gly Ser Pro Lys Tyr Ala Tyr Phe Asn Gly 1 5 10 15

Cys Ser Ser Pro Thr Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr 20 25 30

Lys Leu Val Thr Gly Asp Arg Asn Asn Ser Ser Cys Arg Asn Tyr Asn 35 40 45

Lys Gln Ala Ser Glu Gln Asn Trp Ala Asn Tyr Ser Ala Glu Gln Asn 50 55 60

Arg Met Gly Gln Ala Gly Ser Thr Ile Ser Asn Ser His Ala Gln Pro 65 70 75 80

Phe Asp Phe Pro Asp Asp Asn Gln Asn Ala Lys Lys Val Ala Ala Gly 85 90 95

His Glu Leu Gln Pro Leu Ala Ile Val Asp Gln Arg Pro Ser Ser Arg 100 105 110

Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu 115 120 125

<210> 3

<211> 39

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido <400> 3

Asp Pro Tyr His Ala Thr Ser Gly Ala Leu Ser Pro Ala Lys Asp Cys 1 5 10 15

Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Tyr Phe Asn Gly Cys Ser Ser Pro Thr Ala 20 25 30

Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro 35

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 4

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10

<210> 5

<211> 29

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido <400> 5

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Tyr Phe Asn Gly 1 5 10 15

Cys Ser Ser Pro Thr Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro 20 25

<210> 6

<211> 50

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido <400> 6 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Asp Pro Tyr His Ala 1 5 10 15

Thr Ser Gly Ala Leu Ser Pro Ala Lys Asp Cys Gly Ser Gln Lys Tyr 20 25 30

Ala Tyr Phe Asn Gly Cys Ser Ser Pro Thr Ala Pro Leu Ser Pro Met 35 40 45

Ser Pro 50

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 7

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 8

Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Arg Glu Ile Lys Ile 1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 9

Phe Phe Leu Ile Pro Lys Gly 1 5

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 10 3

Asp Ser Leu Lys Ser Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Phe Ser Trp Arg

5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 11

Lys Leu Trp Met Arg Trp Trp Ser Pro Thr Thr Arg Arg Tyr Gly 1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 12

Arg Leu Trp Met Arg Trp Tyr Ser Pro Trp Thr Arg Arg Trp Gly 1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 13

Arg Leu Ile Met Arg Ile Tyr Ala Pro Thr Thr Arg Arg Tyr Gly 1 5 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 14

Arg Leu Tyr Met Arg Tyr Tyr Ser Pro Thr Thr Arg Arg Tyr Gly 1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular 4

<400> 15

Arg Leu Trp Met Arg Trp Tyr Ser Pro Arg Thr Arg Ala Tyr Gly 1 5 10 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 16

Lys Arg Pro Thr Met Arg Phe Arg Tyr Thr Trp Asn Pro Met Lys 1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 17

Trp Lys Cys Arg Arg Gln Cys Phe Arg Val Leu His His Trp Asn 1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 18

Trp Lys Cys Arg Arg Gln Ala Phe Arg Val Leu His His Trp Asn 1 5 10 15

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<400> 19

Trp Lys Ala Arg Arg Gln Ala Phe Arg Val Leu His His Trp Asn 1 5 10 15

<210> 20

<211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de internalización celular

<220>

<221> BINDING

<222> (1) .. (1)

<223> Biotina <400> 20

Tyr Ser Ser Tyr Ser Ala Pro Val Ser Ser Ser Leu Ser Val Arg Arg 1 5 10 15

Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Gly Ser 20