Nuevos reactivos y procedimiento de conjugación de moléculas biológicas.

Un compuesto de la fórmula general:

X-[NR-CO-Ar-W-(CH≥CH)n-(CH2)2-L]m (I)

en la que representa un polímero;

Ar representa un grupo heteroarilo o arilo opcionalmente sustituido; R representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, arilo o alquil-arilo; W representa un grupo ceto CO; n representa 0 o un número entero de 1 a 4; L representa un grupo saliente; y m representa un número entero de 1 a 8.

Nuevos reactivos y procedimiento de conjugación de moléculas biológicas

La presente invención se refiere a nuevos reactivos y a un nuevo procedimiento para conjugar moléculas biológicas, especialmente proteínas y péptidos.

Muchas moléculas terapéuticamente activas, por ejemplo proteínas, no poseen las propiedades requeridas para lograr una eficacia en el uso médico clínico. Por ejemplo, con muchas proteínas nativas no se fabrican buenas medicinas debido a que después de su administración a los pacientes existen varias desventajas inherentes entre las que se incluyen:

(1) las proteínas son digeridas por muchas endo- y exo-peptidasas presentes en sangre o tejidos; (2) muchas proteínas son inmunógenas en alguna medida; y (3) las proteínas pueden excretarse rápidamente por ultrafiltración en los riñones y por endocitosis. Algunas moléculas que pueden ser útiles como agentes terapéuticos activos en medicinas son sistèmicamente tóxicas o carecen de una biodisponibilidad o una farmacocinética óptimas. Cuando las proteínas se eliminan de la circulación sanguínea rápidamente tienen que administrarse al paciente frecuentemente. La administración frecuente aumenta adicionalmente el riesgo de toxicidad, especialmente toxicidades derivadas inmunológicamente.

Se usan ampliamente polímeros sintéticos hidrosolubles, particularmente polialquilenglicoles, para su conjugación con moléculas terapéuticamente activas, tales como proteínas, péptidos y fármacos de bajo peso molecular. Se ha demostrado que estos conjugados terapéuticos alteran la farmacocinética favorablemente, prolongando el tiempo en circulación y reduciendo velocidades de aclaramiento, reduciendo la toxicidad sistèmica y, en muchos casos, mostrando una eficacia clínica aumentada. El procedimiento de conjugación covalente de polietilenglicol, PEG, con proteínas se conoce comúnmente como "PEGilación".

Es Importante para lograr una eficacia optimizada y para asegurar una coherencia de dosis a dosis que el número de moléculas de polímero conjugadas por proteina sea el mismo para cada molécula, y que cada molécula de polímero esté conjugada específicamente de forma covalente con el mismo residuo de aminoácido en cada molécula de proteina. La conjugación no específica en sitios a lo largo de la molécula de proteina da como resultado una distribución de productos de conjugación y, frecuentemente, proteina no conjugada, dando una mezcla compleja que es difícil y cara de purificar.

Para la conjugación específica de tlol, se usan comúnmente reactivos de PEGilación que tienen una cadena de PEG terminada en un extremo con un grupo malelmlda. Dichos reactivos se describen en muchas publicaciones, por ejemplo el documento WO 2004/060965. Los reactivos terminados en maleimida están disponibles comercialmente. No obstante, muchas PEG-malelmldas son hidrópicamente Inestables durante su almacenamiento y su conjugación con un fármaco experimental. Específicamente, tiene lugar un grado sustancial de hidrólisis del anillo de maleimida, tanto antes como después de la conjugación.

El documento WO 95/34326 y el documento US 5.414.135 divulgan reactivos de PEGilación. Archiv der Pharmazie 316(8) 1983, páginas 657-663 describe estudios cinéticos sobre sulfonas. "Reactive dyes fortextile fibers", Society of Dyers and Colourlsts, 1999, capítulo 1, divulga, describe reacciones de Michael. El documento WO 99/01469 y el documento WO 2006/067221 describen la conjugación de grupos acríllcos con macromoléculas.

Los Inventores han encontrado ahora una clase de reactivos de PEGilación que pueden usarse para conjugar moléculas que Incluyen proteínas y péptidos con polímeros a través de un único residuo nucleófilo, por ejemplo un grupo tlol, y que tiene ventajas sobre dichos reactivos comerciales.

En consecuencia, la presente Invención proporciona un procedimiento para la conjugación de una molécula que contiene un grupo tlol o amino con un polímero, que comprende hacer reaccionar dicha molécula con un compuesto de la fórmula general:

X-[NR-CO-Ar-W-(CH=CH)n-(CH2)2-L]m (I)

en la que X representa un polímero; Ar representa un grupo heteroarilo o arilo opcionalmente sustituido; R representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, arilo o alquil-arilo; W representa un grupo ceto CO; n representa 0 o un número entero de 1 a 4; L representa un grupo saliente; y m representa un número entero de 1 a

8.

El producto directo resultante del procedimiento de la Invención puede representarse, en general, mediante la fórmula siguiente:

X-[NR-CO-Ar-W-(CH=CH)n-(CH2)2-Z]m (¡la)

en la que X, Ar, R, W n y m tienen los significados indicados anteriormente y Z representa dicha molécula conjugada a través de un grupo tlol o amino. SI se desea, este compuesto resultante de fórmula lia puede convertirse en

cualquier otro producto deseado. Específicamente, un compuesto resultante de la fórmula general lia puede convertirse en un compuesto de la fórmula general II

X-[NR-CO-Ar-W'-(CH=CH),-(CH2)2-Z]m (II)

en la que W representa un resto aceptor de electrones o un resto que puede prepararse por reducción de un resto aceptor de electrones.

Los compuesto de la fórmula general (I) son novedosos y la invención, por lo tanto, también proporciona estos compuestos de por sí. Compuestos novedosos particularmente preferentes de la fórmula (I) son los de la fórmula (la) tal como se define más adelante.

Los compuesto de la fórmula general (II) son también novedosos y la invención, por lo tanto, también proporciona estos compuestos de por sí. Compuestos novedosos particularmente preferentes de la fórmula (II) son los de la fórmula (Ila) tal como se define más adelante.

m representa un número entero de 1 a 8, por ejemplo 1 a 6, preferentemente 1 a 4, por ejemplo 1. Cuando m es 1, está conjugada un única molécula con el polímero. Cuando m es mayor de uno, puede realizarse la conjugación de más de una molécula con el polímero. De 2 a 8 grupos- NR-CO-Ar-W'-(CH=CH)n-(CH2)2-Z o -NR-CO-Ar-W- (CH=CH)n-(CH2)2-L se unen al polímero y las variables Ar, R, W, W, n, L y Z pueden ser ¡guales o diferentes para cada uno de dichos grupos. Están disponibles compuesto poliméricos multifuncionales, por ejemplo, pueden unirse múltiples grupos usando como material de partida compuestos con varios brazos disponibles de NOF con la denominación comercial "Sunbright": por ejemplo, los productos con 4 brazos tienen la fórmula C[CH20(CH2Ct-<20)n- Y]4 en la que Y puede ser uno de una serie de grupos terminales diferentes. Los conjugados multiméricos pueden dar como resultado beneficios sinérgicos y aditivos. Por ejemplo, si m es 1, el conjugado resultante debe tener un grupo terminal en el extremo de la cadena PEG alejado de la molécula conjugada. Este es comúnmente un grupo alcoxl o similar, y se ha sugerido que dichos grupos pueden tener como consecuencia efectos inmunógenos no deseados cuando se usan para aplicaciones farmacéuticas. Si m es superior a 1, puede unirse una molécula conjugada a ambos extremos de la cadena de PEG, prescindiendo de la necesidad de un grupo terminal tal como alcoxl.

Un polímero X puede ser, por ejemplo, un polialquilenglicol, una polivinilpirrolidona, un poliacrilato, por ejemplo pollacrllollmorfollna, un polimetacrilato, una polioxazolina, un polijalcohol vinilico), una poliacrilamida o polimetacrilamida, por ejemplo policarboximetacrilamida, o un copolímero HPMA. Adicionalmente, X puede ser un polímero que sea susceptible a degradación enzimàtica o hidrolítica. Dichos polímeros, por ejemplo, incluyen pollésteres, pollacetales, poll(orto-ésteres), policarbonatos, pol¡(¡m¡no-carbonatos) y poliamidas, tales como pollamlnoácldos. Un polímero X puede ser un homopolímero, copolímero aleatorio o un copolímero definido estructuralmente tal como un polímero de bloque. Por ejemplo, X puede ser un copolímero de bloque derivado de dos o más óxidos de alquileno, o de poll(óxldo de alquileno) y también un poliéster, poliacetal, poli(orto-éster) o un poliaminoácido Los polímeros pollfunclonales que pueden usarse incluyen copolímeros de d¡v¡n¡léter-anhídr¡do malelco y estlreno-anhídrldo malelco.

También pueden usarse polímeros de origen natural, por ejemplo polisacáridos tales como quitina, dextrano, dextrina, quitosano, almidón, celulosa, glucógeno, poll(ácldo siálico) y derivados de los mismos. Puede usarse como el polímero una proteina. Esto permite la conjugación de una proteina, por ejemplo un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, con una segunda proteina, por ejemplo una enzima u otra proteina activa. También, s¡ se usa un péptido que contiene una secuencia catalítica, por... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de la fórmula general:

X-[NR-CO-Ar-W-(CH=CH)n-(CH2)2-L]m (I)

en la que representa un polímero; Ar representa un grupo heteroarilo o arilo opcionalmente sustituido; R representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, arilo o alquil-arilo; W representa un grupo ceto CO; n representa 0 o un número entero de 1 a 4; L representa un grupo saliente; y m representa un número entero de 1 a 8.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que X es un polialquilenglicol, polivinilpirrolidona, poliacrilato, polimetacrilato, polioxazolina, poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, polimetacrilamida, copolímero HPMA, poliéster, pollacetal, poli(orto-éster), policarbonato, poH(iminocarbonato), poliamida, copolímero de diviniléter-anhídrido maleico y estlreno-anhídrido maleico, polisacárido o proteína.

3. Un compuesto según la reivindicación 2, en el que X es un polialquilenglicol.

4. Un compuesto según la reivindicación 3, en el que X es un polietilenglicol.

5. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que n es 0.

6. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que L representa -SR, -SO2R, - OSO2R, -N*R3, -N*HR2, -N^hhR, halógeno o -O0, en las que R representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, arilo o alquil-arilo y 0 representa un grupo arilo sustituido que contiene al menos un sustituyente aceptor de electrones.

7. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene la fórmula general:

X-[NH-C0-Ar-W-(CH=CH),-(CH2)2-S02R']m (la)

en la que Ar representa un grupo arilo no sustituido o sustituido y R' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, arilo o alquil-arilo no sustituido o sustituido.

8. Un compuesto según la reivindicación 8, en el que Ar representa un grupo fenilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyeles ¡guales o diferentes seleccionados de, -CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, - OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NRCO2R, -NO, -NHOH, -NR.OH, -C=N-NHCOR, -C=N- NR.COR, -N*R3, -N*H3, -N*HR2, -N^hhR, halógeno, -C=CR,-C=CR2 y -C=CHR, en los que cada R representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, arilo o alquil-arilo.

9. Un compuesto según la reivindicación 8, en el que Ar representa un grupo fenilo y R' representa un grupo p-tolilo.

10. Un procedimiento de conjugación de una molécula que contiene un tiol o un grupo amino con un polímero que comprende hacer reaccionar dicha molécula con un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha molécula es un péptido o una proteína.

12. Un compuesto de una fórmula general II:

X-[NR-CO-Ar-W'-(CH=CH),-(CH2)2-Z]m (II)

en la que X, R, Ar, n y m tienen los significados dados en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, Z representa una molécula conjugada a través de un grupo tiol o amino, y W representa un grupo ceto CO o un grupo que puede prepararse mediante reducción de dicho grupo.

13. Un compuesto según la reivindicación 12, en el que W representa un grupo ceto CO, un grupo CH.OH o un grupo amino CH.NH2, CH.NHR o CH.NR2, en los que cada R representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, arilo o alquil-arilo.

14. Un compuesto según la reivindicación 12, que tiene la fórmula general:

X-[NH-CO-Ar-W-(CH=CH)n-(CH2)2-Z]m(Ha)

en la que Ar representa un grupo arilo no sustituido o sustituido.

15. Un compuesto según la reivindicación 14, en el que Ar representa un grupo fenilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyeles ¡guales o diferentes seleccionados de, -CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, - OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR.CO2R, -NO, -NHOH, -NR.OH, -C=N- NHCOR, -C=N-NR.COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, halógeno, -C=CR,-C=CR2y -C=CHR, en los que cada R representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, arilo o alquil-arilo.

16. Un compuesto según la reivindicación 15, en el que Ar representa un grupo fenilo.

17. Un compuesto según cualquiera de la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que Z es un péptido o una

proteína.

18. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a

5 17 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.