Moléculas biológicas conjugadas y su preparación.

Un compuesto de fórmula general **Fórmula**

en la que uno de X y X' representa un poli(etilenglicol) y el otro representa un átomo de hidrógeno;

cada Q representa independientemente un grupo enlazador;

W representa un grupo ceto CO, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-, o un resto que se puede preparar mediante reducción de dicho grupo;

o, si X' representa un polietilenglicol, X-Q-W- juntos pueden representar un grupo ciano; y

además, si X representa un polietilenglicol, X' y W junto con los átomos interyacentes pueden formar un anillo;

cada uno de Z1 y Z2 representa de forma independiente una proteína, cada uno de los cuales está unido a A y B por un grupo tiol;

A es una cadena alquileno o alquenileno C1-5; y

B es un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C1-4.

Moléculas biológicas conjugadas y su preparación La presente invención se refiere a moléculas biológicas conjugadas y a su preparación a partir de nuevos derivados químicamente funclonalizados de polietilenglicol.

Muchas moléculas terapéuticamente activas no tienen las propiedades requeridas para lograr eficacia en el uso médico clínico. Por ejemplo, ahora, Industria farmacéutica está descubriendo y produciendo mediante Ingeniería genética proteínas y polipéptidos terapéuticamente activos. Aunque en la actualidad se comercializan en Estados Unidos al menos 80 medicinas basadas en proteínas y hay al menos 350 medicinas más basadas en proteínas sometidas a ensayos clínicos (Harris J, Chess R: Effect of Pegylation on pharmaceuticals. Nature Review Drug Discover y , 2003, 2, 214 – 221) , la mayoría de las proteínas naturales no son medicinas buenas porque, después de administración a pacientes, hay varios inconvenientes Inherentes entre los que se incluyen: (1) las proteínas son digeridas por muchas endopeptidasas y exopeptidasas presentes en la sangre o en tejidos, (2) muchas proteínas son inmunogénicas en cierta medida y (3) las proteínas pueden excretarse rápidamente mediante ultrafiltraclón en el riñón. Entre otras moléculas usadas como agentes terapéuticos activos en medicinas que son slstémicamente tóxicas o carecen de biodisponibilidad y farmacocinética óptimas se incluyen moléculas de bajo peso molecular de las que una dosis eficaz está limitada por la toxicidad. Tales moléculas se usan rutinariamente para tratar la inflamación y afecciones debidas a neoplasias malignas, infección y enfermedades autoinmunes.

Se usan polímeros sintéticos solubles en agua, en particular polialquilenglicoles, para conjugar moléculas terapéuticamente activas tales como proteínas. Se ha demostrado que estos conjugados terapéuticos alteran favorablemente la farmacocinética prolongando el tiempo de circulación y disminuyendo las velocidad de aclaración, disminuyen la toxicidad slstémlca y, en varios casos, presentan una eficacia clínica mayor, Este procedimiento de conjugar covalentemente polietilenglicol, PEG, a proteínas, se conoce habitualmente como "PEGilación", aunque se han examinado muchos polímeros diferentes como polímeros de conjugación.

Muchos reactivos de conjugación de polímero comprenden conjugar una funcionalidad química que es hidrolíticamente Inestable. Son ejemplos de reactivo de conjugación de polímero hidrolíticamente inestables son los ésteres activos que Incluyen, por ejemplo, carbonatos de óxido de polialquileno-N-succinimida (Zalipsky, patente de EE.UU. Nº.122.614) . Estos reactivos tienen semivldas relativamente cortas en medio acuoso, que incluye sangre o plasma. Esto da por resultado la necesidad de añadir excesos estequiométricos grandes del reactivo de conjugación de polímero. La estabilidad hidrolítica del reactivo es importante porque el requisito de añadir excesos estequiométricos para la conjugación de proteínas requiere un esfuerzo y un coste significativos para purificar el conjugado de polímero-proteína de la mezcla de reacción. Además, estos reactivos hidrolíticamente inestables tienden a reaccionar preferentemente con la funcionalidad química amina de la proteína, en particular con la amina e de los restos de lisina. Puesto que la mayoría de las proteínas de interés tienen más de un resto de lisina y, frecuentemente, muchos restos de lisina, la conjugación tiende a ser inespecífica en cuanto a que se produce en muchos sitios del resto en la proteína. Es posible purificar la mezcla de reacción de conjugación para aislar proteínas conjugadas a una molécula de polímero, aunque no es posible aislar a un coste razonable conjugados de polímeroproteína de los que la totalidad están conjugados al mismo grupo amina en la proteína. Frecuentemente, la conjugación inespecífica da como resultado una función proteínica alterada. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con unión de poli (óxido de etileno) al azar mediante restos de lisina dan como resultado anticuerpos modificados (o fragmentos de anticuerpo modificados) capaces de unirse al antígeno diana con afinidad, avidez o especificad reducida. Además, los reactivo de conjugación de polímero específicos requieren una condiciones de la reacción de conjugación que deben seleccionarse para asegurar que las aminas de la proteína no están protonadas. Estas condiciones requieren un medio con un pH moderadamente alto (8-10) , lo que permite que los restos amina sean lo suficientemente reactivos como para reaccionar con el reactivo de conjugación del polímero. Frecuentemente, las condiciones de un pH alto son perjudiciales para la proteína y causan cambios estructurales y desnaturalización. Estos procesos dan como resultado la alteración de la función proteínica. Los reactivos de conjugación de polímero específicos de amina tienden a unirse a sitios accesibles de la amina en la proteína. Estos reactivos se pueden llamar reactivos cinéticos. Son lábiles y sufren una reacción con la mayoría de los sitios nucleofílicos amino evaluables de la proteína. Los reactivos de conjugación de polímero específicos de amina que se conjugan mediante acilación de amina dan como resultado la pérdida de carga positiva en el grupo amina del resto de aminoácido en la proteína que normalmente estaría presente en condiciones fisiológicas para la proteína no conjugada. Estos rasgos de los reactivo de conjugación de polímero específicos de amina frecuentemente conducen a una alteración parcial de la función de la proteína. Otros grupos funcionales de conjugación incorporados en los polímeros para la conjugación a proteínas y que son específicos de aminas y con frecuencia hidrolíticamente lábiles incluyen los isocianatos (documento WO 94/04193) y los carbonatas (documento WO 90/13540) .

Particularmente relevante para una eficacia optimizada y para asegurar la consistencia de dosis a dosis es cuidar de que el número de moléculas de polímero conjugadas por proteína sea el mismo y que cada molécula de polímero esté específicamente conjugada covalentemente al mismo resto de aminoácido en cada molécula de proteína. La conjugación inespecífica en sitios a lo largo de una molécula de proteína da como resultado una distribución de productos de conjugación y, frecuentemente, proteína no conjugada, obteniéndose una mezcla compleja que es

difícil, laboriosa y cara de purificar.

Se han desarrollado reactivo de conjugación de polímero específicos de tiol para proteínas con el fin abordar las limitaciones a la propensión de los reactivos de conjugación a experimentar hidrólisis que sea competitiva con la conjugación a la proteína, la conjugación no específica de polímero en diferentes restos de aminoácido de la proteína y la necesidad de condiciones de pH alto en la reacción de conjugación. Los reactivo de conjugación de polímero específicos de tiol se pueden utilizar a valores del pH próximos a la neutralidad, en los que los restos funcionales amina en los restos de aminoácidos de la proteína están protonados y, por tanto, no pueden competir eficazmente en la reacción de conjugación con el reactivo de conjugación del polímero. Los reactivo de conjugación de polímero específicos de tiol que son relativamente más estables hidrolíticamente que los reactivos específicos a amina mencionados anteriormente se pueden utilizar en un exceso estequiométrico menor, de modo que se reducen los costes durante la purificación del conjugado polímero-proteína. Entre los restos funcionales de conjugación que son ampliamente selectivos para los grupos tiol se incluyen yodoacetamida, maleimlda (documento WO 92/16221) , vinilsulfona (documentos WO 95/13312 y WO 95/34326) , vinilpiridinas (documento WO 88/05433) y ésteres acrilato y metacrilato (documento WO 99/01469) . Estos restos de conjugación selectivos de tiol dan un único tioéter que conjuga el enlace entre el polímero.

La mayoría de las proteínas no tienen sulfhidrales libres porque estos sulfhidrales experimentan reacciones de reorganización y desbarajuste con los puentes disulfuro dentro de la proteína, dando como resultado una función proteínica empeorada. Para las proteínas que sí tienen sulfhidrales libres, con frecuencia estos sulfhidrales son críticos para la función de la proteína. Típicamente, en una proteína, el número de restos sulfhidrales es inferior al número de restos amina (por ejemplo, Lisina o histidina) . Puesto que la conjugación a una proteína puede hacerse que sea específica en los grupos tiol y puesto que las proteínas típicamente no tienen grupos tiol libres, hay ejemplos de modificación específica del sitio de la proteína mediante... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de fórmula general

en la que uno de X y X' representa un poli (etilenglicol) y el otro representa un átomo de hidrógeno;

cada Q representa independientemente un grupo enlazador;

W representa un grupo ceto CO, un grupo éster -O-CO-o un grupo sulfona -SO2-, o un resto que se puede preparar mediante reducción de dicho grupo; o, si X' representa un polietilenglicol, X-Q-W-juntos pueden representar un grupo ciano; y además, si X representa un polietilenglicol, X' y W junto con los átomos inter y acentes pueden formar un anillo;

cada uno de Z1 y Z2 representa de forma independiente una proteína, cada uno de los cuales está unido a A y B por un grupo tiol;

A es una cadena alquileno o alquenileno C1-5; y

B es un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C1-4.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que cada grupo enlazador Q representa independientemente un enlace directo, un grupo alquileno o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido, cualquiera de los cuales puede estar terminado o interrumpido por uno o varios átomos de oxígeno, átomos de azufre, grupos -NR en los que R representa un grupo alquilo o arilo, grupos ceto, grupos -O-CO-y/o grupos -CO

O-.

3. Un procedimiento de preparación de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende hacer reaccionar, bien (i) un compuesto de fórmula general

en la que uno de X y X' representa un poli (etilenglicol) y el otro representa un átomo de hidrógeno; cada Q representa independientemente un grupo enlazador; W' representa un grupo ceto, un grupo éster -O-CO-o un grupo sulfona -SO2-; o, si X' representa un

polietilenglicol, X–Q–W' juntos pueden representar un grupo ciano; A representa una cadena alquileno o alquenileno C1-5; B representa un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C1-4; y

cada L representa independientemente un grupo saliente;

o bien (ii) un compuesto de fórmula general

en la que X, X', Q, W', A y L tienen los significados dados para la fórmula general II y, además, si X representa un polietilenglicol, X’ y W’ junto con los átomos inter y acentes pueden formar un anillo, y m representa un número entero de 1 a 4; con los compuestos de fórmula general Z1Nu y Z2Nu en la que cada un representa un grupo tiol.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el, o cada, grupo saliente L representa –SR, – SO2R, –OSO2R, –N+R3, –N+HR2, – N+H2R, halógeno o –OØ, en las que R representa un grupo alquilo o arilo y Ø representa un grupo arilo sustituido que contiene al menos un sustituyente aceptor de electrones.

5. Una composición farmacéutica, que comprende un compuesto fisiológicamente tolerable de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso como medicamento.